家蠶免疫系統(tǒng)相關基因的鑒定及其誘導表達模式研究.pdf

1、家蠶是典型的鱗翅目模式昆蟲，也是一種完全依靠人類飼養(yǎng)才得以生存的重要經濟昆蟲，其基礎研究有著良好的積累，并保存有大量的突變體及繁育系。對家蠶免疫相關基因的研究，不僅可以促進人們了解家蠶免疫應答的分子調控機制，也可以促進人們對昆蟲的分子調控機制的理解，并為昆蟲免疫分子的多樣性研究提供線索。借鑒果蠅的免疫研究成果，利用家蠶基因組精細圖、基因芯片和EST等多種家蠶的數(shù)據(jù)資源，通過生物信息學分析，我們對家蠶的免疫系統(tǒng)相關基因進行了鑒定，對一些關

2、鍵基因進行了克隆，并對關鍵基因家族進行了比較和系統(tǒng)進化研究，重點探討了它們的免疫誘導表達模式和功能，最后對家蠶免疫應答的分子機制進行探討。獲得的主要研究結果如下： 1.家蠶的免疫系統(tǒng)相關基因 采用果蠅和按蚊所有免疫相關基因在家蠶基因組中進行同源性分析的方法，鑒定家蠶的免疫系統(tǒng)相關基因。我們鑒定了家蠶21個基因家族的218個免疫相關基因，主要包括：(1)模式識別受體，如PGRP、GNBP、凝集素和清道夫受體等基因家族；(2

3、)4個信號傳導途徑的相關基因：如Toll途徑的Spz、Toll、MyD88、Pelle、Tube、TRAF2和Cactin，Imd途徑的FADD、Dredd、TAK1、TAB、IKKβ、IKKΥ和Relish，JAK/STAT途徑的Domeless、Hopscotch和STAT：(3)7類抗菌肽家族的基因。其中，大約65％的基因具有EST表達證據(jù)；大約90％的基因已經定位到相應的染色體上，這為將來的基因功能研究提供了重要信息。系統(tǒng)進化分

4、析發(fā)現(xiàn)家蠶的免疫相關基因在昆蟲中都很保守。模式識別受體和抗菌肽基因則具有明顯的物種特異性，在家蠶基因組中具有多個物種特異的拷貝，序列分化和物種特異的基因重復現(xiàn)象明顯，暗示它們受到更小的環(huán)境選擇壓力。同時，發(fā)現(xiàn)45個家蠶-果蠅-按蚊-蜜蜂的1：1：1：1的直系同源基因，其中，信號傳導途徑的基因都顯示1：1：1：1直系同源關系，推測家蠶擁有與果蠅等其它昆蟲類似的免疫應答信號傳導機制。 2.基于全基因組芯片的免疫誘導表達譜分析

5、 本研究運用包含22987個基因探針的全基因組芯片，通過大腸桿菌(革蘭氏陰性細菌)和蘇云金芽孢桿菌(革蘭氏陽性細菌)誘導5齡第3天家蠶幼蟲，在4個時間點對脂肪體進行了轉錄組比較分析。芯片掃描結果顯示，總共有9961個探針有表達信號(信號值＞400)，占總探針數(shù)的43.3％，與此前的組織芯片結果相似。采用ratio＞2倍的標準篩選差異表達基因，我們獲得了210個上調表達的基因和200個下調表達的基因。通過基因功能分類，結果顯示上調表達的基

6、因主要是免疫應答相關基因，包括模式識別受體、抗菌肽基因、絲氨酸蛋白酶及其抑制劑相關基因、黑化級聯(lián)相關基因和調摔鐵元素代謝的基因等。而下調表達的基因主要是一些能量代謝和生化酶類基因，包括細胞色素P450超家族的基因、表皮蛋白基因、低密度脂蛋白、激素相關基因、動力相關蛋白編碼基因，以及與常規(guī)代謝有關的酶基因等。這種表達模式反映了昆蟲脂肪體組織作為免疫應答器官的生理特征。 3.家蠶的Toll相關受體基因家族 Toll受體在先天

7、免疫和發(fā)育中有重要作用，它們含有胞外亮氨酸富集結構域和胞內的TIR結構域，在昆蟲和脊椎動物中都非常保守。通過與果蠅的Toll受體比較，發(fā)現(xiàn)家蠶基因組中含有13個Toll樣受體，分別命名為BmToll、BmToll-2到11、BmToLK-1和BmToLK-2。染色體定位顯示有8個成員位于第23號染色體上，其中BmToll、BmToll-2和BmToll-7是家蠶特有的亞群。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，家蠶的Toll受體與其它昆蟲的基因明顯形成7個

8、進化亞群，其中，BmToll-6、BmToll-8和BmToll-9與果蠅和按蚊的基因呈明顯的直系同源關系。通過組織和發(fā)育時期的基因芯片數(shù)據(jù)分析，結果表明BmToll和BmToll-2在卵巢中富集表達，暗示其可能在胚胎發(fā)生中起重要作用：而BmToll-2和BmToll-4在幼蟲的中腸富集表達，推測它們可能參與免疫防御。另外，BmToll-10和BmToll-11和BmToLK-2在精巢特異表達暗示它們可能與性別特異的生物學功能有關。同時

9、，我們采用RT-PCR技術檢測了10個Toll基因在大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白僵菌誘導下的表達譜，結果顯示絕大多數(shù)基因存在表達差異。如在注射大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的樣品中BmToll的表達明顯被抑制；而BmToll-2則是在注射大腸桿菌和白僵菌的樣品中表達量明顯下調。相反，BmToll-3的表達量在三組誘導樣品中都明顯上調。家蠶Toll受體的鑒定和表達譜分析，將為我們研究Toll相關受體的生物學功能和Toll信號傳導途徑的分子機制提

10、供幫助。 4.家蠶的抗菌肽基因家族 通過與已報道的昆蟲抗菌肽的同源性分析，我們發(fā)現(xiàn)家蠶基因組總共包含有39個抗菌肽基因，包括12個Moricins、12個Cecropins、7個Gloverins、3個Attacins、2個Lebocins、2個Enbocins和1個Defensin。其中，Moricin和Gloverin為鱗翅目昆蟲特有的抗菌肽基因家族，并且成簇分布在基因組上。序列相似性和染色體定位信息表明，家蠶的抗菌

11、肽基因是由祖先基因經歷了多次復制產生的基因家族。而這種物種特異的基因復制現(xiàn)象有可能反映了抗菌肽基因在免疫系統(tǒng)中起著非常關鍵的作用，因而產生多個基因拷貝以抵御不同的病原微生物。 5.家蠶抗菌肽基因的系統(tǒng)進化和誘導表達模 家蠶基因組包含了比其它昆蟲更多的抗菌肽基因，其中Moricin、Cecropin和Gloverin等三個基因家族都含有多個拷貝。通過計算編碼序列的同義突變和非同義突變，發(fā)現(xiàn)這些基因家族的同義突變/非同義突變

12、(dN/ds)都小于1，分別為0.637、0.487和0.202，并且信號肽的比值比成熟肽的比值明顯更大，暗示了成熟肽趨于更強的穩(wěn)定性選擇。在這三個家族中，受到的進化負選擇壓力大小關系為Moricin＜Cecropin＜Gloverin。結合抗菌譜和誘導表達活性的差異分析，發(fā)現(xiàn)選擇壓力小的Moricin和Cecropin家族成員之間的抗菌譜和誘導表達活性的差異明顯比Gloverin家族的更大。二級和三級結構預測顯示，Moricin和Ce

13、cropin家族都由α-螺旋組成，而正選擇位點也主要位于該區(qū)域。 通過家蠶抗菌肽的抗菌活性和誘導表達差異與序列差異的關聯(lián)分析，我們可以得出如下推論：家蠶抗菌肽基因家族可能存在主要抗菌功能基因的強免疫誘導模式。家蠶的抗菌肽Moricin、Cecropin和Gloverin基因可能通過不等交換產生多拷貝基因家族。并且在與微生物的協(xié)同進化過程中，抗菌肽基因的編碼序列受到不同的選擇壓力，導致部分氨基酸的改變，從而改變抗菌肽的分子結構和相

14、應的靜電勢。這些變化最終導致抗菌肽家族成員間的抗菌譜和抗菌活性的差異。例如，Cecropin家族和鱗翅目特異的Moricin家族是由序列差異導致抗菌活性和誘導表達差異的典型家族，BmcecBJ、BmcecD和BmmorA1等三個基因都具有高抗菌活性和高誘導表達的特點，推測它們可能承擔了主要的抗菌功能，其它成員可能具有協(xié)同抗菌功能。而鱗翅目特異的Gloverin家族的序列分化比前兩個家族小，功能上的分化也不如它們明顯，并不完全符合高抗菌活

15、性和高誘導表達的規(guī)律。例如，BmglvA2符合高抗菌活性和高誘導表達的規(guī)律，而BmglvB具有較高的抗菌活性，但是誘導表達水平卻相對最低。家蠶抗菌基因家族的這種特征可能為基因家族的分子進化以及功能分化的理解和由復制而來的新基因的命運提供了一個很好的研究模式。 6.家蠶抗菌肽基因表達的調控網絡 綜合上述分析，初步提出家蠶的抗菌肽基因表達調控網絡，其步驟大致可分為4個：首先，家蠶在受到細菌感染時，模式識別受體PGRPs和GN