LPS誘導(dǎo)的免疫相關(guān)基因在免疫系統(tǒng)中潛在功能的研究.pdf

1、外界病原微生物可以從機體的不同部位侵入,并通過各種機制誘發(fā)疾病的產(chǎn)生。當(dāng)外界致病微生物穿越了人體的上皮屏障,并在宿主的組織內(nèi)開始大量復(fù)制時,會被定居在組織中的單核吞噬細胞以及巨噬細胞所識別。巨噬細胞在機體遭遇病原微生物的入侵時能夠迅速做出反應(yīng),一方面進行吞噬病原體,另一方面能夠釋放大量的效應(yīng)分子引起組織內(nèi)的炎癥反應(yīng),進而控制感染。機體的免疫系統(tǒng)對抗原識別過程依賴于不同模式識別受體(pattern recognition receptor

2、s,PRR)來完成的,如TLRs(Toll like receptors)、NLRs(NOD-like receptors)、RLH(RIG-likehelicases)等。Toll樣受體作為先天性免疫系統(tǒng)中的重要組成部分,主要通過識別病原微生物表面的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)來啟動免疫反應(yīng),進而清除外來抗原。
　　 脂多糖LPS(lipopoly

3、saccharide)是革蘭氏陰性菌細胞壁的組成成分,能夠引起多種免疫細胞發(fā)生形態(tài)、功能以及胞內(nèi)基因表達的變化,并導(dǎo)致宿主細胞因子失控性地表達,介導(dǎo)嚴重感染、器官損傷以及敗血癥休克等多種疾病的產(chǎn)生。研究表明,LPS能夠被細胞表面的TLR4分子所識別,并將信號傳遞至胞內(nèi),激活下游的多條信號,如MAPK(Mitogen activated protein kinase)、NF-κB(Nuclearfactor kappa-light-cha

4、in-enhancer of activated B cells)、AKT/PKB等信號途徑,引發(fā)細胞產(chǎn)生一系列的固有免疫分子,如細胞因子(cytol(ine)和趨化因子(chemokines),包括IL-1(Interleukin.1)、TNF-α(Tumor necrosis factor-α)、IL-6(Imerleukin-6)、IL-12(Interleukin-12)及趨化因子IL-8(Interleukin-8)等等。TL

5、R家族不僅能夠啟動天然免疫應(yīng)答,控制炎癥反應(yīng)的性質(zhì)、強度以及持續(xù)時間,還可以通過上調(diào)抗原提呈細胞(antigen-presenting cell,APC)表面的共刺激分子以及MHCⅡ的表達,促進APC的成熟,參與抗原特異性免疫應(yīng)答,尤其是Th1型反應(yīng)的產(chǎn)生,調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答的強度以及類型,成為連接天然免疫(innate immunity)和獲得性免疫應(yīng)答(adaptive immunity)的樞紐。但是,TLR信號過度活化或著活化不足

6、,都會導(dǎo)致機體功能異常以及疾病的發(fā)生,因此其調(diào)控過程受到其它很多信號通路的正向或負向調(diào)控,使之維持適度的活化平衡。
　　 在LPS誘導(dǎo)的TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中,多種蛋白參與其調(diào)節(jié)過程。目前只是對其中一些關(guān)鍵的分子研究的較深入。LPS刺激細胞能夠引起眾多基因表達量的變化,參與其信號調(diào)節(jié)過程。如何篩選到這些基因以及探索其功能仍是任重道遠。本課題組通過對比小鼠活化與非活化狀態(tài)的脾細胞EST數(shù)據(jù)庫,篩選到一些在可能在免疫系統(tǒng)中具有潛在功

7、能的基因。并針對其中的部分基因做了一定的研究。本文重點介紹Rab10、Sik1這兩個基因。實驗通過LPS刺激樹突狀細胞(dendritic cell,DC),發(fā)現(xiàn)隨著LPS刺激時間的不同,Rab10及Sik1都呈現(xiàn)一定的變化趨勢,暗示Rab10及Sik1在可能在免疫調(diào)節(jié)中扮演一定的角色。
　　 在Rab10基因的研究過程中,實驗通過構(gòu)建了Rab10過表達的質(zhì)粒在RAW264.7細胞、原代巨噬細胞中瞬時過表達Rab10以及構(gòu)建了R

8、ab10穩(wěn)定沉默的細胞系Rab10iA及Rab10KD251,在體外研究Rab10在免疫調(diào)節(jié)中的功能。最后通過小鼠急性肺損傷模型在體內(nèi)驗證了Rab10在免疫系統(tǒng)中可能的功能。研究結(jié)果表明,Rab10蛋白在LPS誘導(dǎo)的TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有重要的作用。Rab10蛋白能夠提高IFN-β、NF-κB啟動子的活性,增強MAPK、NF-κB、IRF3信號途徑,上調(diào)LPS誘導(dǎo)的相關(guān)細胞因子如TNF-α、IL-6、IFN-β等的表達,其具體機制是

9、通過輔助TLR4從高爾基體轉(zhuǎn)運至細胞膜,增強LPS誘導(dǎo)的TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。
　　 在Sik1基因的研究過程中實驗構(gòu)建了Sik1過表達以及RNA干擾的腺病毒載體,在RAW264.7中過表達Sik1以及在DC細胞中進行RNA干擾等實驗。研究結(jié)果表明,SIK1蛋白能夠增強LPS誘導(dǎo)的MAPK、NF-κB信號途徑,提高NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,促進促炎癥因子IL-6、IL-12、TNF-α的表達,抑制抗炎因子IL-10