家蠶Tollip基因在抗菌免疫中的功能研究.pdf

1、蠶業(yè)生產(chǎn)中，家蠶遭受病原微生物的感染而發(fā)病，是蠶繭產(chǎn)量、質(zhì)量受損的主要因素。研究家蠶應對病原微生物入侵時的免疫應答機制，對于提高其抗病能力，促進蠶業(yè)經(jīng)濟發(fā)展具有重要意義。
　　先天性免疫應答是昆蟲和哺乳動物抵御病原微生物入侵的第一道防線。目前，對于昆蟲先天性免疫機制的認知主要集中在模式昆蟲——果蠅中。家蠶是鱗翅目昆蟲先天性免疫研究最為充分的模式生物，也有一些關于家蠶應對病原微生物入侵時免疫應答研究的報道。家蠶的先天性免疫主要分為體

2、液免疫和細胞免疫。體液免疫主要包括血淋巴的黑化作用和抗菌肽的分泌。而這其中抗菌肽的分泌則主要集中在脂肪體、血細胞等組織中，在病原微生物入侵宿主后，激活Toll和IMD通路調(diào)控下游靶基因的表達。
　　Toll通路互作蛋白(Tollip)是Toll樣受體(TLR)-介導的先天性免疫應答中的關鍵調(diào)控因子。關于Tollip基因?qū)oll通路的調(diào)控機制及相關功能目前還不完全清楚;為了探討Tollip基因在昆蟲應對病原微生物入侵時的免疫應答機

3、制及功能，對家蠶的BmTollip基因及BmTollip在家蠶應對不同類型細菌入侵時的免疫應答機制進行了研究，取得結果如下:
　　(1)克隆了家蠶Tollip基因，將其命名為BmTollip。通過生物信息學軟件分析，鑒定得知其cDNA長度為1009bp，ORF有663個核苷酸，編碼220個氨基酸，分子量為25.17KDa，等電點為5.71。SMART軟件在線預測BmTollip蛋白含有C2和CUE結構域，Clustal W軟件分析

4、不同物種Tollip序列的平均相似性為64.29％，與玉帶鳳蝶的相似性高達85.71％，證明Tollip在不同物種之間具有保守性。
　　(2)利用大腸桿菌BL21進行了BmTollip蛋白表達，通過SDS-PAGE分析在25KDa-35KDa中間位置獲得清晰目標蛋白條帶。
　　(3)通過Ni柱體外純化BmTollip蛋白，制備抗體，IELISA實驗檢測了其效價。
　　(4)采用qRT-PCR分析了家蠶五齡幼蟲感染不同細

5、菌后脂肪體BmTollip基因表達變化。金黃色葡萄球菌（Lys型肽聚糖革蘭氏陽性菌）感染家蠶時，脂肪體中BmTollip在3h-6h發(fā)生極顯著降低，表明它發(fā)揮了負調(diào)控作用;而后6-24h逐步上調(diào)。利用枯草芽孢桿菌（DAP型肽聚糖革蘭氏陽性菌）感染家蠶時，BmTollip基因表達在1-3h內(nèi)有上升，但在6h反而有所下降，隨后再逐步上調(diào)。顯示Lys型肽聚糖的金黃色葡萄球菌比DAP型肽聚糖枯草芽孢桿菌對家蠶的免疫應答更為敏感和強烈。而在用革蘭

6、氏陰性菌（大腸桿菌）感染時，除3-6hBmTollip發(fā)生極顯著降低外，還發(fā)現(xiàn)BmTollip在12-24h出現(xiàn)了第二次強烈的免疫應答。推測家蠶在免疫應答革蘭氏陰性菌時，BmTollip還參與了其它通路的反應而發(fā)揮功能。
　　(5)通過Western Blot實驗從蛋白質(zhì)水平證明了家蠶BmTollip基因表達在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平是完全一致的。
　　(6)通過細胞免疫熒光染色實驗，發(fā)現(xiàn)BmN細胞在金黃色葡萄球菌感染48h