家蠶Tollip基因在抗菌免疫中的功能研究.pdf

1、蠶業(yè)生產(chǎn)中，家蠶遭受病原微生物的感染而發(fā)病，是蠶繭產(chǎn)量、質(zhì)量受損的主要因素。研究家蠶應(yīng)對(duì)病原微生物入侵時(shí)的免疫應(yīng)答機(jī)制，對(duì)于提高其抗病能力，促進(jìn)蠶業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。
　　先天性免疫應(yīng)答是昆蟲和哺乳動(dòng)物抵御病原微生物入侵的第一道防線。目前，對(duì)于昆蟲先天性免疫機(jī)制的認(rèn)知主要集中在模式昆蟲——果蠅中。家蠶是鱗翅目昆蟲先天性免疫研究最為充分的模式生物，也有一些關(guān)于家蠶應(yīng)對(duì)病原微生物入侵時(shí)免疫應(yīng)答研究的報(bào)道。家蠶的先天性免疫主要分為體

2、液免疫和細(xì)胞免疫。體液免疫主要包括血淋巴的黑化作用和抗菌肽的分泌。而這其中抗菌肽的分泌則主要集中在脂肪體、血細(xì)胞等組織中，在病原微生物入侵宿主后，激活Toll和IMD通路調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。
　　Toll通路互作蛋白(Tollip)是Toll樣受體(TLR)-介導(dǎo)的先天性免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵調(diào)控因子。關(guān)于Tollip基因?qū)oll通路的調(diào)控機(jī)制及相關(guān)功能目前還不完全清楚;為了探討Tollip基因在昆蟲應(yīng)對(duì)病原微生物入侵時(shí)的免疫應(yīng)答機(jī)

3、制及功能，對(duì)家蠶的BmTollip基因及BmTollip在家蠶應(yīng)對(duì)不同類型細(xì)菌入侵時(shí)的免疫應(yīng)答機(jī)制進(jìn)行了研究，取得結(jié)果如下:
　　(1)克隆了家蠶Tollip基因，將其命名為BmTollip。通過生物信息學(xué)軟件分析，鑒定得知其cDNA長度為1009bp，ORF有663個(gè)核苷酸，編碼220個(gè)氨基酸，分子量為25.17KDa，等電點(diǎn)為5.71。SMART軟件在線預(yù)測BmTollip蛋白含有C2和CUE結(jié)構(gòu)域，Clustal W軟件分析

4、不同物種Tollip序列的平均相似性為64.29％，與玉帶鳳蝶的相似性高達(dá)85.71％，證明Tollip在不同物種之間具有保守性。
　　(2)利用大腸桿菌BL21進(jìn)行了BmTollip蛋白表達(dá)，通過SDS-PAGE分析在25KDa-35KDa中間位置獲得清晰目標(biāo)蛋白條帶。
　　(3)通過Ni柱體外純化BmTollip蛋白，制備抗體，IELISA實(shí)驗(yàn)檢測了其效價(jià)。
　　(4)采用qRT-PCR分析了家蠶五齡幼蟲感染不同細(xì)

5、菌后脂肪體BmTollip基因表達(dá)變化。金黃色葡萄球菌（Lys型肽聚糖革蘭氏陽性菌）感染家蠶時(shí)，脂肪體中BmTollip在3h-6h發(fā)生極顯著降低，表明它發(fā)揮了負(fù)調(diào)控作用;而后6-24h逐步上調(diào)。利用枯草芽孢桿菌（DAP型肽聚糖革蘭氏陽性菌）感染家蠶時(shí)，BmTollip基因表達(dá)在1-3h內(nèi)有上升，但在6h反而有所下降，隨后再逐步上調(diào)。顯示Lys型肽聚糖的金黃色葡萄球菌比DAP型肽聚糖枯草芽孢桿菌對(duì)家蠶的免疫應(yīng)答更為敏感和強(qiáng)烈。而在用革蘭

6、氏陰性菌（大腸桿菌）感染時(shí)，除3-6hBmTollip發(fā)生極顯著降低外，還發(fā)現(xiàn)BmTollip在12-24h出現(xiàn)了第二次強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。推測家蠶在免疫應(yīng)答革蘭氏陰性菌時(shí)，BmTollip還參與了其它通路的反應(yīng)而發(fā)揮功能。
　　(5)通過Western Blot實(shí)驗(yàn)從蛋白質(zhì)水平證明了家蠶BmTollip基因表達(dá)在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平是完全一致的。
　　(6)通過細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)BmN細(xì)胞在金黃色葡萄球菌感染48h