家蠶BmTPRn基因的表達及其功能初步研究.pdf

1、我們從本實驗室構(gòu)建的家蠶cDNA文庫中篩選得到一條的cDNA，經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其包含TPR(TetratricoPeptid.Repea.domain)保守結(jié)構(gòu)域，將其命名為家蠶BmTPRn基因。家蠶B.TPRn基因是我們在家蠶中首次發(fā)現(xiàn)的一個TPR蛋白超家族基因，它只含有一個外顯子；家蠶BmTPRn基因cDNA長為135.bp，ORF大小為85.bp，編碼285個氨基酸，預(yù)測分子量為31.1kD，等電點為4.75。
　　

2、本實驗根據(jù)cDNA序列的ORF框設(shè)計上下游引物，PCR擴增出目的基因，插入融合表達載體pET-28a(+)，成功構(gòu)建重組表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR、酶切鑒定以及測序分析證實重組正確。終濃度為0.5mM的IPTG誘導(dǎo)后裂解菌體做SDS-PAGE分析，在35kD處有特異性蛋白條帶，與預(yù)測值相符。成功的通過Ni-NTA柱親和層析得到純化的重組蛋白。用該重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，ELISA檢測效價

3、在1:1.800以上。提取家蠶各時期及組織的RNA，設(shè)計特異引物利用RT-PCR檢測BmTPRn在轉(zhuǎn)錄水平上差異。結(jié)果表明：BmTPRn基因在卵巢中的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于其他的組織；在各時期中，基因BmTPRn在蛹的轉(zhuǎn)錄水平最高。提取家蠶卵、五齡幼蟲、蛹、蛾四個時期及五齡幼蟲的頭、卵巢、絲腺等組織的總蛋白，進行免疫印跡實驗，結(jié)果顯示，在五齡幼蟲的卵巢中BmTPRn基因表達量明顯高于其他組織和RT-PCR的實驗結(jié)果相一致，在頭中沒有檢測到表達