家蠶BmCRP基因的原核表達(dá)和功能初步研究.pdf

1、從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶蛹cDNA文庫中篩選到一條cDNA序列，該序列為首次報道，GenBank登錄號為DN985186.1，由4個外顯子和3個內(nèi)含子構(gòu)成。該序列長度為101.bp，ORF長67.bp，編碼224個氨基酸殘基，編碼的蛋白的N-端富含半胱氨酸，所以把它命名為BmCRP(Bomby.mor.cys-ric.protein)，生物信息學(xué)預(yù)測其分子量24.9.kD，預(yù)測等電點(diǎn)為5.12。將BmCRP與數(shù)據(jù)庫中的蛋白進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)該蛋

2、白僅與昆蟲果蠅中的一些假想蛋白具有一些同源性(最高的同源性為31％)，而在其他種屬中同源性較低。
　　 通過PCR擴(kuò)增BmCRP的ORF，純化產(chǎn)物經(jīng)BamHI和Xh.I雙酶切后插入到pET-28a(+)的Bam.I和Xh.I位點(diǎn)，篩選獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-BmCRP，經(jīng)PCR、雙酶切鑒定以及測序分析證實(shí)重組正確，篩選陽性克隆，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。工程菌經(jīng).mM的IPTG誘導(dǎo)后，收集菌體并裂解，作SDS

3、-PAGE分析，結(jié)果在2.kD處有一濃集目的蛋白條帶，與預(yù)期值相符。融合蛋白以不溶性的包涵體的形式存在，超聲波裂解菌體分離包涵體并離心、洗滌；對包涵體進(jìn)行溶解和梯度透析復(fù)性；采用親和層析純化融合蛋白rBmCRP。以該融合蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔，制備了rBmCRP多克隆抗體，ELISA檢測該抗體的效價可達(dá)到1:6400。免疫印跡檢測顯示該抗體對rBmCRP具有較好的特異性。免疫印跡檢測結(jié)果還表明，BmCRP在家蠶五齡幼蟲的頭部、表皮、