家蠶性別決定相關(guān)基因Bmrbp1的克隆及原核表達(dá).pdf

1、家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，更是經(jīng)典遺傳學(xué)研究的模式生物之一。許多研究證明雄蠶比雌蠶抗性好，體質(zhì)強(qiáng)，葉絲轉(zhuǎn)化率高，單養(yǎng)雄蠶可在不增加成本的前提下提高15﹪的產(chǎn)絲量，而且雄蠶絲纖度細(xì)、偏差小，絲質(zhì)好，利于繅制高檔生絲。因此，研究家蠶的性別決定機(jī)制，最終實現(xiàn)單養(yǎng)雄蠶可以有效地提高蠶業(yè)生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益。同時鱗翅目昆蟲是主要的農(nóng)林害蟲，而家蠶是鱗翅目昆蟲的典型代表，解明家蠶的性別決定機(jī)制，以家蠶的性別決定機(jī)制為模式，有助于開展農(nóng)林害蟲防治的研究。

2、 經(jīng)典遺傳學(xué)研究表明家蠶的性別由W染色體上的一個強(qiáng)雌性決定因子(fem)決定，而到目前為止fem丕沒有鑒定出來，在家蠶中已經(jīng)找到了果蠅性別決定級聯(lián)末端基因dsx的同源體基因Bmdsx，與果蠅中的dsx相似，Bmdsx的初級轉(zhuǎn)錄物在雌性和雄性中通過選擇性拼接產(chǎn)生性別特異性成熟mRNA，編碼雄特異性(BmDSXM)和雌特異性(BmDSXF)蛋白從而決定家蠶性別的末端分化。但是Bmdsx基因前體mRNA的選擇性拼接機(jī)制與果蠅dsx不同，

3、果蠅中默認(rèn)的拼接方式為雄特異性，在雌性中tra/tra-2激活了雌特異性拼接，而家蠶中Bmdsx認(rèn)的拼接方式為雌特異性的，雄性中由于受到一個阻遏物的作用而產(chǎn)生雄特異性拼接形式。rbp1是參與果蠅前體mRNA雌特異性拼接的一個重要拼接因子，本文對該基因在家蠶中的同源體Bmrbp1進(jìn)行了研究。 本研究的內(nèi)容與結(jié)果為： (1)利用家蠶EST數(shù)據(jù)克隆了果蠅Bmrbp1基因在家蠶中的同源體Bmrbp1，其mRNA全長820bp，編

4、碼142個氨基酸的蛋白，分子量為16.79kD，等電點為11.58，N端含有一個RRM結(jié)構(gòu)域，C端含有一個RS結(jié)構(gòu)域，氨基酸序列比對分析表明Bmrbp1與rbp1的氨基酸序列相似性達(dá)到77﹪，將mRNA序列與家蠶基因組序列比較表明Bmrbp1由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，且所有的外顯子/內(nèi)含子拼接邊界均符合經(jīng)典的GT-AG規(guī)則。 (2)為了研究Bmrbp1基因在家蠶雌雄各組織中的表達(dá)情況，以家蠶脂肪體(雌雄)、絲腺(雌雄)、中腸

5、(雌雄)、體壁(雌雄)、頭部(雌雄)、精巢、卵巢cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，RT-PCR結(jié)果表明Bmrbp1基因在所檢測的家蠶雌雄各組織中均有表達(dá)。為了進(jìn)一步研究Bmrbp1基因在家蠶雌雄中是否有表達(dá)差異，根據(jù)已經(jīng)克隆的mRNA序列設(shè)計熒光定量PCR引物和探針，以家蠶剛化蛹cDNA為模板，通過熒光定量PCR分析表明Bmrbp1在家蠶雌雄中并無表達(dá)差異。 (3)以pET-28a(+)為表達(dá)載體，將Bmrbp1基因整個編碼區(qū)