家蠶羧酸酯酶基因的克隆、序列分析及原核表達(dá).pdf

1、羧酸酯酶是一種廣泛存在于動(dòng)物，植物及細(xì)菌等生物的多功能酶系。根據(jù)序列相似性和底物特異性，羧酸酯酶可以分為8個(gè)亞家族：α-酯酶，β-酯酶，保幼激素酯酶，乙酰膽堿酯酶，神經(jīng)趨化蛋白，神經(jīng)連接蛋白，gliotactin和glutactin。羧酸酯酶家族的基因功能高度分化，部分具有水解活性的α-酯酶或β-酯酶基因在昆蟲觸角中表達(dá)，具有降解性信息素和其他外源氣味分子的功能，是昆蟲體內(nèi)重要的氣味降解酶。
　　近年來，昆蟲觸角羧酸酯酶對(duì)信息素和

2、植物揮發(fā)性氣味物質(zhì)的降解研究使我們對(duì)羧酸酯酶基因功能有了新的認(rèn)識(shí)。由于其在嗅覺系統(tǒng)中表達(dá)，并具有氣味降解活性，因此它們參與了昆蟲的嗅覺反應(yīng)，在維持嗅覺的正常生理功能方面具有至關(guān)重要的作用。但是已有的其他研究，僅關(guān)注的是昆蟲成蟲觸角中的羧酸酯酶的氣味降解功能，但是幼蟲的嗅覺組織中是否也存在羧酸酯酶基因的表達(dá)，它們能否對(duì)外源氣味物質(zhì)進(jìn)行降解？這一問題值得進(jìn)一步的研究。家蠶是鱗翅目昆蟲的重要模式生物之一，在遺傳學(xué)研究上具有重要地位。與果蠅、按

3、蚊幼蟲不同，家蠶幼蟲生活在開放的陸地環(huán)境中，是一種寡食性的昆蟲，其寄主植物氣味信號(hào)濃度較低且易受到有毒物質(zhì)如殺蟲劑的影響。研究家蠶COEs幼蟲嗅覺組織中羧酸酯酶對(duì)揮發(fā)性的寄主植物氣味物質(zhì)和殺蟲劑的降解作用，可為其他鱗翅目害蟲的防治奠定基礎(chǔ)。
　　本研究室前期研究發(fā)現(xiàn)，家蠶幼蟲觸角和下顎中至少存在11個(gè)羧酸酯酶基因的表達(dá)，其中部分基因與已鑒定的鱗翅目昆蟲氣味降解酯酶和信息素降解酯酶為直系同源基因。本文選取了在家蠶幼蟲嗅覺感器表達(dá)的B

4、mae32，Bmae33，Bmae35羧酸酯酶基因，參照ESTs拼接結(jié)果設(shè)計(jì)了特異性引物，從家蠶頭組織中克隆這3個(gè)基因，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)這些基因編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析；利用半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)這3個(gè)基因的組織表達(dá)模式進(jìn)行分析；構(gòu)建Bmae32和Bmae35的原核表達(dá)載體，并對(duì)Bmae35進(jìn)行了外源誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳親和層析柱純化，Western blotting鑒定。結(jié)果如下：
　　1.經(jīng)cDNA克隆，家蠶羧

5、酸酯酶Bmae32、Bmae33和Bmae35基因的完整編碼序列長(zhǎng)度分別為1623bp、1656bp和1581bp，這3個(gè)基因均由3個(gè)外顯子與2個(gè)內(nèi)含子組成，外顯子/內(nèi)含子邊界處均符合GT-AG規(guī)則。Bmae32基因共分別編碼540個(gè)氨基酸，其分子量為61.7kD，等電點(diǎn)為8.72，含有1個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，19個(gè)磷酸化位點(diǎn)；Bmae33基因共分別編碼551個(gè)氨基酸，其蛋白質(zhì)分子量為62.15kD，等電點(diǎn)為5.87，含有7個(gè)潛在的N

6、-糖基化位點(diǎn)，27個(gè)磷酸化位點(diǎn)；Bmae35基因共分別編碼526個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為59.19kDa，等電點(diǎn)為6.39，含有5個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，18個(gè)磷酸化位點(diǎn)。
　　2.經(jīng)Signal IP 3.0在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Bmae32，Bmae33和Bmae35可能分別含有24、24和15個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，因此這三個(gè)蛋白可能均為分泌蛋白。與其他昆蟲觸角酯酶的多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)Bmae32，Bmae33和Bmae35編碼的蛋白具有酯

7、酶活性必須的催化殘基：Ser，Glu和His，也保持著α-酯酶家族特征基序Gly-x-Ser-x-Gly。進(jìn)化分析和序列相似性顯示：家蠶這三個(gè)羧酸酯酶基因都屬于α-酯酶家族，其中Bmae32基因與甘藍(lán)夜蛾觸角酯酶基因Mbra-EST可能為直系同源基因，氨基酸一致性為58.8％；Bmae33基因與多音天蠶氣味降解酶Apol-ODE和?；页嵋苟暧|角酯酶Slit-EST可能為直系同源基因，與Apol-ODE氨基酸一致性為73.1%，與Slit

8、-EST氨基酸一致性為64.6%；Bmae35與蛀莖夜蛾觸角酯酶Snon-EST可能為直系同源基因，氨基酸序列一致性為48.6%。
　　3.表達(dá)模式分析表明：Bmae32基因在家蠶5齡第3天頭，血液和絲腺組織中有高表達(dá)。Bmae33基因在頭，馬氏管和體壁組織中有高表達(dá)，而在Bmae35在各組織中均有表達(dá)，其中在頭，脂肪體，馬氏管，體壁和絲腺的有高表達(dá)。并且Bmae35在雌蛾信息腺中表達(dá)，與性信息素合成呈正相關(guān)，暗示該基因在信息素合