楊樹PtCDD基因的原核表達(dá)及酶活分析.pdf

1、木材形成是形成層細(xì)胞分化為木質(zhì)部細(xì)胞，包括細(xì)胞的膨大、次生壁沉積及細(xì)胞的程序化死亡(PCD)的過程，核酸酶是其細(xì)胞最終死亡的重要參與者之一，對它的進(jìn)一步研究不但為PCD過程提供分子生物學(xué)證據(jù)，認(rèn)識樹木木材形成的PCD過程的特征，研究其凋亡機(jī)制是否與動物一樣，還是有其自身途徑，而且有助于揭示木材形成的分子基礎(chǔ)，并回答次生壁的形成與細(xì)胞PCD的時(shí)間關(guān)系問題。因此本論文對楊樹核酸酶的進(jìn)一步體外表達(dá)、產(chǎn)物純化、鑒定，將為揭示木材形成的PCD過程

2、提供重要的依據(jù)，有其重要的理論價(jià)值，而且通過認(rèn)識PCD過程在木材形成過程中的作用，為木材品質(zhì)的改良奠定理論基礎(chǔ)。 本研究從來自毛白楊形成層區(qū)域獲得的cDNA中擴(kuò)增得到Ca2+依賴型DNase(PtCDD)全長基因并將其與原核表達(dá)載體pET-30b(+)相連接，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-30b(+)-PtCDDI。并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中。通過改變各種外界環(huán)境條件，均未得到目的蛋白。表明該基因的全長表達(dá)可能會對大

3、腸桿菌或載體本身產(chǎn)生重要影響，不能獲得大量表達(dá)產(chǎn)物。通過對該基因結(jié)構(gòu)的分析，克隆了該基因的催化功能域和Ca2+結(jié)合域的一部分，以期能夠降低該蛋白與DNA的結(jié)合能力，使其能夠在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)。將擴(kuò)增出的包含該P(yáng)tCDD功能域的基因片段與原核表達(dá)載體pET-30b(+)相連接，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-30b(+)-PtCDDF，對原核表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)對該蛋白的表達(dá)形式進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其積累并形成包涵體。對楊樹PtCDD蛋