雞IFN-γ基因的克隆及原核表達(dá).pdf

1、γ-干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)是一類(lèi)主要由活化的T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，其作用包括廣泛的抗微生物感染(病毒、細(xì)胞內(nèi)寄生菌和寄生蟲(chóng))、抗腫瘤和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。尤其在抗病毒感染和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能方面作用顯著，是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)主要的免疫調(diào)節(jié)因子之一，因此可望研發(fā)成為新型天然生物佐劑。為此，本研究進(jìn)行了雞IFN-γ基因的克隆和原核表達(dá)，為進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。研究?jī)?nèi)容：1.雞IFN-γ基因的克隆。用刀豆素(Co

2、nA)刺激分離的脾淋巴細(xì)胞后，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴(kuò)增IFN-γ基因，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-T-easy載體連接，獲得pGEM-T-easy/CHIFN-γ重組質(zhì)粒，對(duì)其進(jìn)行酶切、PCR及基因測(cè)序鑒定，結(jié)果表明，本研究克隆得到了完整的雞IFN-γ基因，與GeneBank中登錄的雞IFN-γ基因序列完全一致，而且還發(fā)現(xiàn)ConA刺激誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞6h、8h效果較好。2.雞IFN-γ基因的原核表達(dá)。在雞IFN-γ基因

3、開(kāi)放閱讀框(ORF)兩側(cè)設(shè)計(jì)表達(dá)引物，以pGEM-T-easy/CHIFN-γ質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pGEX-4T-1分別用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，純化回收后連接獲得pGEX-4T-1/CHIFN-γ重組質(zhì)粒；進(jìn)一步將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，提取質(zhì)粒，酶切、PCR及基因測(cè)序鑒定正確的重組菌用ITPG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物。 結(jié)果表明，雞IFN-γ基因插入方向正確，并在大腸桿菌中被成功表達(dá)，