雞α干擾素(ChIFN-α)的克隆和原核表達(dá).pdf

1、研究目的：構(gòu)建雞α干擾素(ChIFN-α)的原核表達(dá)體系，優(yōu)化表達(dá)條件。
　　 研究方法：(1)從GenBank庫中查找雞α干擾素(ChIFN-α)基因并且獲得其基因序列及蛋白序列，用DNAman軟件設(shè)計引物。(2)分離并培養(yǎng)雞血淋巴細(xì)胞，從ConA刺激過8～10小時的雞血淋巴細(xì)胞中提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增出雞α干擾素(ChIFN-α)基因，經(jīng)低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳后回收純化，將純化產(chǎn)物與載體pM

2、D18-T連接，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在氨芐陽性瓊脂板上篩選陽性菌落。重組載體用PCR擴(kuò)增法和兩種限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和EcoRⅠ酶切進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行序列測定，命名為pMD18-T-Ckα。(3)將兩種限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和EcoRⅠ酶切pMD18-T-Ckα的產(chǎn)物回收純化后，與載體PET30a載體連接，轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，在卡那陽性瓊脂板上篩選陽性菌落，用PCR擴(kuò)增法和三種限制性內(nèi)切

3、酶NdeⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ(基因序列290位的酶切位點(diǎn))酶切進(jìn)行鑒定，并再次進(jìn)行測序，命名為PET30a-Ckα。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。(4)經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳圖條帶分析，并結(jié)合濕菌重篩選出最優(yōu)表達(dá)菌種，進(jìn)行培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時間，表達(dá)溫度，表達(dá)時間和誘導(dǎo)劑濃度方面表達(dá)，確定最優(yōu)表達(dá)條件；(5)超聲破菌，分離得到包涵體，并進(jìn)行洗滌純化復(fù)性，Bradford法測定蛋白含量。
　　 研究結(jié)果：(1)成功培養(yǎng)出雞血淋巴細(xì)胞，并

4、成功提取到總RNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增出雞α干擾素(ChIFN-α)基因。(2)成功構(gòu)建出PET30a-Ckα表達(dá)體系，在E.coli BL21(DE3)中表達(dá)出雞α干擾素(ChIFN-α)蛋白，其分子量約為22KD，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在。(3)通過優(yōu)化表達(dá)，結(jié)果在E.coli BL21(DE3)中37C培養(yǎng)濃度達(dá)到OD600值為0.7時加IPTG至終濃度為1mmol/L，再誘導(dǎo)3h表達(dá)，此時表達(dá)量達(dá)到最高，約占全菌蛋白的30％以上。

5、(4)進(jìn)一步純化表達(dá)，用0.1mol/L Tris.cl(PH8.5)含2 mol/L尿素洗滌效果最好，表達(dá)量約占全菌蛋白的40％，采取梯度稀釋法復(fù)性得到雞α干擾素(ChIFN-α)蛋白，利用鎳柱親和層析柱200 mmol/L咪唑洗脫獲得純化蛋白。
　　 研究結(jié)論：應(yīng)用基因工程技術(shù)，成功篩選出雞α干擾素(ChlFN-α)基因，并構(gòu)建了原核表達(dá)載體PET30a-Ckα。通過優(yōu)化表達(dá)，得到雞α干擾素(ChIFN-α)蛋白的最優(yōu)表達(dá)條