雞干擾素α、γ在昆蟲細胞中的共表達.pdf

1、干擾素(Interferon, IFN)是多功能細胞因子家族中的一員，是一類高活性多功能的糖蛋白，隨著分子生物學及DNA重組技術(shù)的迅速發(fā)展，已經(jīng)應用基因工程技術(shù)為人類抗腫瘤、抗病毒生產(chǎn)出大量高效的干擾素。本研究以雞為研究對象，克隆出了雞干擾素α和γ全基因，然后亞克隆到昆蟲細胞/桿狀病毒表達載體中，并對其在細胞中的表達進行了初步研究。主要內(nèi)容包括：
　　 1．參照GenBank發(fā)表的雞干擾素α和γ基因序列，分別設(shè)計引物，提取淋巴細

2、胞總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)擴增，然后克隆到pGEM-T Easy載體上，經(jīng)PCR，酶切鑒定和序列測定，證明克隆出的片段為雞干擾素α和γ基因。與網(wǎng)上的其他物種干擾素基因進行序列比較，再次證明其為正確的雞干擾素α和γ基因。
　　 2．為了在桿狀病毒表達載體中表達雞干擾素α和γ基因，分別設(shè)計引物，將編碼雞干擾素α和γ的成熟蛋白基因亞克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual中，分別置于pH和P10啟動子控

3、制下，獲得重組質(zhì)粒pFB-CG。并且在雞干擾素成熟肽序列之前引入蜂素信號肽替代了原有的信號肽，以期達到雞干擾素α和γ蛋白的分泌型表達。為便于重組蛋白的檢測和應用鎳親和層析柱進行純化，在表達基因的C端融合6×His標簽。
　　 3．轉(zhuǎn)化含穿梭載體Bacmid的感受態(tài)細胞DH10Bac，發(fā)生轉(zhuǎn)座作用，經(jīng)抗性及藍白斑篩選得到含雞干擾素α和γ基因的重組質(zhì)粒rDH10-CG。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，SDS-PAGE可檢測到分子質(zhì)量為1