γδT細胞及干擾素調(diào)節(jié)因子在肝細胞癌中的作用研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是危害我國國民健康的常見惡性腫瘤之一，在西方國家的發(fā)病率也呈上升趨勢。全球每年有60-70萬人死于肝癌，約55％發(fā)生在中國。手術(shù)治療仍舊是肝癌最有效的治療手段，術(shù)后高轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率已成為提高肝癌遠期療效的瓶頸。針對這一難題，學(xué)者們早期從肝癌細胞本身出發(fā)，發(fā)現(xiàn)了大量的癌細胞相關(guān)基因，并針對這些基因進行了靶向治療，但均未取得滿意的療效。近年來逐漸重視從腫瘤微環(huán)境角度出發(fā)，探索各種免疫治療手段，試圖改變腫瘤免疫反應(yīng)狀態(tài)，從而探索治療腫瘤

2、的有效干預(yù)手段[1]。然而，由于許多問題沒有闡明，目前尚無突破性進展。但對于部分患者而言，肝癌局部有效的免疫反應(yīng)有助于改善臨床進展，甚至提高患者生存率[21。
　　 T淋巴細胞是腫瘤免疫微環(huán)境的重要組成部分，許多T細胞亞群在腫瘤免疫中的作用得到了深入研究與認識：細胞毒性T細胞及NKT細胞(Nature kill Tcells；NK T cells)發(fā)揮抑癌免疫效應(yīng)，輔助性T細胞向不同方向分化(如Th1、Th2、Th7、Treg細

3、胞)也可發(fā)揮不同的免疫效應(yīng)[3-5]?？傮w上，上述這些細胞均屬于αβT細胞(T細胞受體雙肽鏈由α鏈及β鏈構(gòu)成)，而與之相對應(yīng)的γδT細胞(T細胞受體雙肽鏈由γ鏈及δ鏈構(gòu)成)由于在外周血中比例低(僅占成熟T細胞總數(shù)的5-10％)，過去研究不受重視。然而，這群細胞在肝臟中特殊富集，可高達局部總T細胞總數(shù)的35％，在肝臟中發(fā)揮重要的免疫監(jiān)視作用[6]。
　　 γδT細胞是一群兼有固有免疫、特異性免疫雙重特征的T細胞，具有殺傷與調(diào)節(jié)雙重

4、功能，在局部免疫穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮著不可替代的作用[7]。其主要免疫特點如下：1)T細胞受體(T-cell receptor；TCR)多態(tài)性有限，激活不依賴抗原遞呈細胞，不受主要組織相容性抗原(maior histocompatibility antigen；MHC)限制，因此最初被認為是固有免疫的重要組成部分；2)本身能發(fā)揮抗原遞呈作用，為幼稚型αβT細胞的增殖、分化及活化提供共刺激信號，從而介導(dǎo)特異性免疫的誘導(dǎo)、活化[8]；3)在組織

5、中可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[7]。動物實驗中表明γδT細胞可通過直接殺瘤作用、早期大量分泌IFN-γ及抑制αβT細胞中的促癌細胞成分來抑制腫瘤的發(fā)生與進展[9]。體外實驗證實，γδT細胞能以TCR依賴/非依賴方式殺傷多種腫瘤細胞(結(jié)直腸癌[10]、腎細胞癌[11]、卵巢癌[12]、骨髓瘤[13])及腫瘤干細胞[14]。磷酸化抗原能有效地刺激γδT細胞增殖與活化，增強其殺傷腫瘤細胞的效率[14]。然而，這群細胞在腫瘤微環(huán)境中的免疫狀態(tài)及與其他免

6、疫細胞間的相互作用研究仍是一片空白。
　　 γδT細胞是體內(nèi)γ干擾素(Interferon-γ；IFN-γ)的重要來源[15]。IFN-γ通過促進異常細胞凋亡，參與腫瘤免疫監(jiān)視[15，16]，IFN-γ缺陷小鼠(IFN-γ受體缺失或IFN-γ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵分子STAT-1缺失)化學(xué)誘導(dǎo)腫瘤發(fā)病潛伏期明顯縮短，發(fā)病率高于正常小鼠。然而，腫瘤細胞在IFN-γ的長期選擇壓力下發(fā)生免疫選擇(Immunoselection)，主要表現(xiàn)為被動

7、改變自身免疫原性、通過IFN-γ信號通路相關(guān)調(diào)節(jié)分子變異等改變對IFN-γ的敏感性，從而實現(xiàn)腫瘤免疫逃逸。干擾素調(diào)節(jié)因子(Interferon regulatory factors；IRFs)是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)IFN-γ效應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，其中IRF-1介導(dǎo)典型的IFN-γ效應(yīng)，而IRF-2能與IRF-1競爭DNA結(jié)合序列，從而為IRF-1提供負反饋抑制信號。腫瘤細胞內(nèi)IRF-1、IRF-2的表達一定程度上反映了腫瘤細胞對內(nèi)源性干擾素的敏感性

8、。多項臨床研究表明，腫瘤細胞內(nèi)存在IRF-1表達缺失及IRF-2的過表達，且這一特征與腫瘤的惡性表型相關(guān)[17-19]。然而，兩者在肝細胞癌中的表達特點及與肝癌生物學(xué)特性關(guān)系尚未闡明。
　　 本課題以肝細胞癌免疫微環(huán)境為主要研究對象，一、從γδT細胞入手，借助組織分離純化淋巴細胞、流式細胞儀分析γδT細胞在肝癌局部的浸潤及免疫狀態(tài)，通過流式細胞儀或磁珠分選儀分選γδT細胞及調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory Tcells；Tre

9、g細胞)，采用共培養(yǎng)及相關(guān)免疫學(xué)方法分析Treg細胞對γδT細胞效應(yīng)功能的抑制。我們發(fā)現(xiàn)，γδT細胞在外周血中比例較低，但在肝臟中大量浸潤，而肝細胞癌中浸潤卻較癌旁肝組織中明顯降低；肝細胞癌浸潤性γδT細胞表現(xiàn)為功能抑制表型、殺傷功能明顯減弱；肝細胞癌內(nèi)γδT細胞與Treg細胞間明顯負相關(guān)，Treg細胞通過轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ，TGFβ)、白介素10(Interleukin10；IL-1

10、0)依賴途徑抑制γδT細胞的殺傷功能。二、從固有免疫分子IFN-γ相關(guān)調(diào)節(jié)因子(干擾素調(diào)節(jié)因子[Interferon regulatory factor；IRF]1與IRF-2)出發(fā)，利用免疫組織化學(xué)染色、RNA干擾及相關(guān)的分子生物學(xué)探討內(nèi)源性IFN-γ在塑造肝細胞癌中的作用。我們發(fā)現(xiàn)肝細胞癌表達的IRF-1、IRF-2與肝癌預(yù)后相關(guān)，IRF-2/IRF-1比值可能通過影響STAT-3/MMP-9改變肝癌細胞的侵襲性。
　　 第

11、一部分γδT細胞在肝癌患者不同部位中的分布與表型研究
　　 本研究旨在探索γδT細胞在肝細胞癌患者體內(nèi)不同部位中(外周血循環(huán)、癌旁肝組織、肝癌病灶)的分布、亞群組成及免疫表型差異。
　　 通過不連續(xù)密度梯度離心法分離同一肝癌患者外周血單個核細胞(Peripheralblood mononuclear cells；PBMCs)、癌旁浸潤淋巴細胞(Peritumor infiltratinglymphocytes；PILs)

12、及肝癌浸潤淋巴細胞(Tumor infiltrating lymphocytes；TILs)，借助流式細胞技術(shù)分析不同部位γδT細胞分布、亞群組成(Vδ1+T細胞、Vδ2+T細胞)及免疫表型(免疫活化表型、成熟分化表型及激活型受體NKG2D)差異；利用免疫組織化學(xué)染色分析肝癌組織及癌旁組織中γδT細胞浸潤特點及絕對計數(shù)變化。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，γδT細胞在肝臟中浸潤明顯高于外周血，而在肝癌組織中的浸潤較癌旁組織明顯減少，減少的程度

13、與肝癌病期正相關(guān)；免疫活化標志(CD86、CD83、CD80、HLA-DR、CD25)表達無明顯差別；肝癌組織中γδT細胞表達激活型受體NKG2D較癌旁及外周血中顯著減少；基于CD27、CD45RA的免疫效應(yīng)細胞成熟表型分析顯示肝癌內(nèi)γδT細胞具有成熟表型的比例較癌旁明顯減少；肝癌內(nèi)γδT細胞亞群組成以Vδ1+T細胞為主，而癌旁肝組織中γδT細胞亞群組成以Vδ2+T細胞為主。免疫組織化學(xué)染色分析顯示γδT細胞主要分布在實質(zhì)細胞間隙浸潤，

14、肝癌組織內(nèi)計數(shù)明顯低于癌旁組織。
　　 本實驗表明肝癌組織內(nèi)γδT細胞浸潤較癌旁組織明顯減少，且減少程度與肝癌病期正相關(guān)。肝癌內(nèi)γδT細胞存在成熟分化障礙及激活型受體表達抑制，提示其殺傷功能可能受到抑制。
　　 第二部分γδT細胞在肝癌患者不同部位中殺傷功能研究
　　 本研究旨在明確γδT細胞在肝細胞癌患者體內(nèi)不同部位中(外周血、癌旁肝組織、肝癌病灶)的殺傷功能差異。
　　 通過不連續(xù)密度梯度分離同一肝癌

15、病人外周血單個核細胞(Peripheral bloodmononuclear cells；PBMCs)、癌旁浸潤淋巴細胞(Peritumor infiltratinglymphocytes；PILs)及肝癌浸潤淋巴細胞(Tumor infiltrating lymphocytes；TILs)，借助流式細胞儀分析同一肝癌患者不同部位γδT細胞表達穿孔素、顆粒酶、脫顆粒水平及IFN-γ分泌差異；借助免疫磁珠技術(shù)，分離純化肝癌組織、癌旁組織中

16、浸潤的γδT細胞，通過流式細胞為基礎(chǔ)的體外殺傷實驗檢測γδT細胞體外殺傷肝癌細胞系水平差異；通過ELISPOT技術(shù)檢測分離純化后的γδT細胞在非特異性及特異性刺激下分泌IFN-γ差異；通過分離純化肝癌組織、癌旁組織中浸潤的γδT細胞，采用全基因組芯片技術(shù)分析其表達譜差異。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌浸潤性γδT細胞雖然表達Perforin及Granzyme B水平與癌旁浸潤性γδT細胞相比無差異，但在非特異性刺激(PMA+Ionomyc

17、in)下表達CD107a明顯減弱，表明肝癌浸潤性γδT細胞存在脫顆粒障礙；肝癌浸潤性γδT細胞在非特異性刺激(PMA+Ionomycin)下表達IFN-γ顯著減少；肝癌浸潤性γδT體外殺傷肝癌細胞系(HCCLM3、MHCC97H、MHCC97L、PLC、HuH7、7721)的效率明顯低于癌旁浸潤性γδT細胞；肝癌浸潤性γδT在肝癌細胞系刺激下分泌IFN-γ水平也較癌旁浸潤性γδT細胞明顯減少；全基因組表達譜分析發(fā)現(xiàn)，肝癌浸潤性γδT細胞

18、“自然殺傷性細胞通路(Natural killer cell mediated cytotoxicity)”、“T細胞受體通路(T cell receptor signalling pathway)”及“原發(fā)性免疫缺陷通路(Primary immunodeficiency)”受損，這與前面發(fā)現(xiàn)的體外殺傷功能降低相吻合。
　　 本實驗表明，肝癌浸潤性γδT細胞存在殺傷功能及IFN-γ分泌缺陷。
　　 第三部分調(diào)節(jié)性T細胞介

19、導(dǎo)γδT細胞功能抑制的研究
　　 本研究旨在闡明肝癌微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T cells；Treg細胞)對γδT細胞效應(yīng)功能的抑制及其相關(guān)分子機制。
　　 利用流式淋巴細胞分離及流式細胞技術(shù)分析Treg細胞在肝癌患者不同部位中的分布情況，建立其與γδT細胞間的相關(guān)性；通過淋巴細胞分離及流式細胞儀分選獲取肝癌組織中Treg細胞；免疫磁珠技術(shù)分離純化癌旁組織中γδT細胞。Treg細胞與γδT細胞體外共培

20、養(yǎng)后進行殺傷功能檢測、IFN-γ分泌檢測；共培養(yǎng)體系中加入抗體(抗TGFβ、抗IL-10、抗CTLA-4抗體)阻斷Treg細胞的抑制作用；體外殺傷功能檢測及IFN-γ分泌檢測體系中加入重組細胞因子(TGFβ、IL-10)模擬Treg細胞對γδT細胞效應(yīng)功能的抑制作用。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)Treg細胞在肝癌組織內(nèi)大量浸潤，比例上與γδT細胞呈明顯負相關(guān)；體外Treg細胞能顯著抑制γδT細胞對肝癌細胞系的殺傷，同時下調(diào)γδT細胞激活型受

21、體NKG2D表達及其在肝癌細胞刺激下的FN-γ分泌；抗CTLA-4中和抗體不能阻斷Treg細胞的抑制功能；而抗TGFβ、抗IL-10中和抗體能顯著阻斷Treg細胞的抑制功能，兩者聯(lián)合應(yīng)用無明顯協(xié)同作用；TGFβ、IL-10重組細胞因子能有效模擬Treg細胞對γδT細胞的抑制效應(yīng)，兩者聯(lián)合應(yīng)用無明顯協(xié)同作用。
　　 本研究表明Treg細胞通過TGFβ、IL-10直接介導(dǎo)γδT細胞效應(yīng)功能抑制。
　　 第四部分干擾素調(diào)節(jié)因子

22、1/2表達與肝癌預(yù)后及侵襲性的相關(guān)研究
　　 干擾素調(diào)節(jié)因子(Interferon regulatory factor；IRF)1與IRF-2是介導(dǎo)干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要轉(zhuǎn)錄因子，其表達異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要相關(guān)性。本研究旨在通過分析IRF-1、IRF-2與肝癌患者預(yù)后及肝癌生物學(xué)特性的相關(guān)性，探討內(nèi)源性IFN-γ在塑造肝細胞癌中的作用。
　　 通過免疫組織化學(xué)染色，分析IRF-1、IRF-2在332例肝細胞癌患者肝癌

23、組織中的表達及其與肝癌患者預(yù)后、臨床免疫特征間的關(guān)系，蛋白水平分析IRF-1、IRF-2在肝癌細胞系中的表達及其與肝癌細胞系侵襲潛能的相關(guān)性，通過干擾IRF-1、IRF-2在肝癌細胞系中的表達及相關(guān)的功能實驗分析IRF-1、IRF-2影響肝癌細胞侵襲性的機制。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)IRF-1瘤內(nèi)低表達與肝癌術(shù)后不良預(yù)后相關(guān)，而IRF-2相反，其瘤內(nèi)高表達與肝癌術(shù)后不良預(yù)后相關(guān)；多因素分析顯示IRF-2/IRF-1比值是肝癌預(yù)后的獨立預(yù)

24、測指標。通過檢測IRF-1、IRF-2在高低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞系中表達，發(fā)現(xiàn)IRF-2/IRF-1比值高低與肝癌細胞侵襲性正相關(guān)。干擾實驗表明IRF-2/IRF-1比值可能通過STAT-3影響MMP-9表達介導(dǎo)肝癌細胞侵襲性改變。
　　 本研究表明IRF-1與IRF-2在肝癌細胞內(nèi)表達水平與肝癌患者預(yù)后及侵襲性相關(guān)，IRF-2/IRF-1比值可能通過STAT-3影響MMP-9表達介導(dǎo)肝癌細胞侵襲性改變。
　　 結(jié)論

25、　　 1γδT細胞在肝癌內(nèi)浸潤減少，減少程度與病期正相關(guān)；肝癌浸潤性γδT細胞表現(xiàn)為功能抑制表型。
　　 2肝癌浸潤性γδT細胞脫顆粒及IFN-γ分泌障礙，體外殺傷肝癌細胞系效率減低；基因芯片分析提示其“自然殺傷性細胞通路”、“T細胞受體通路”及“原發(fā)性免疫缺陷通路”受損。
　　 3肝癌內(nèi)Treg細胞與γδT細胞比例上呈負相關(guān)，Treg細胞通過TGFβ、IL-10直接介導(dǎo)γδT細胞效應(yīng)功能抑制。
　　 4干擾素

26、調(diào)節(jié)因子(Interferon regulatory factor；IRF)1與IRF-2在肝癌細胞內(nèi)表達水平與肝癌患者預(yù)后及侵襲性相關(guān)，IRF-2/IRF-1比值可能通過sTAT-3影響MMP-9表達介導(dǎo)肝癌細胞侵襲性改變。
　　 創(chuàng)新點
　　 1首次明確γδT細胞在肝癌內(nèi)浸潤減少，腫瘤浸潤性γδT細胞呈現(xiàn)功能抑制表型及效應(yīng)功能缺陷。
　　 2首次證實肝癌微環(huán)境中Treg細胞對γδT細胞效應(yīng)功能的抑制，并闡明T