核因子-κB及干擾素調(diào)節(jié)因子3在抗腫瘤免疫中的作用.pdf

1、核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)是幾乎表達(dá)于所有有核細(xì)胞，參與細(xì)胞幾乎所有的生命活動(dòng)，并且在自身免疫性疾病、腫瘤等人類疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮中重要作用。特別是在很多腫瘤中的高表達(dá)，提示了其在促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，但NF-κB在抗腫瘤免疫中的作用研究較少。本課題組長(zhǎng)期從事NF-κB通路的相關(guān)研究。本課題組在前期研究的基礎(chǔ)上，探索NF-κB通路及干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory

2、 factor3，IRF3）通路活化對(duì)抗腫瘤免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。
　　本課題研究分為以下三個(gè)部分:
　　第一部分，首先構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞系及對(duì)照細(xì)胞系，包括LLC-Mig、LLC-IKKβ、LLC-OVA-Mig及LLC-OVA-IKKβ。其次體外驗(yàn)證了組成型活化的IKKβ可以在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，并能促進(jìn)下游信號(hào)分子NF-κB轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)目的基因趨化因子配體1(chemokine(C-X-C motif) l

3、igand1，cxcl1)的表達(dá)。
　　第二部分，利用所構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株接種C57BL/6小鼠，發(fā)現(xiàn)LLC-Mig和LLC-IKKβ細(xì)胞都可以在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定成瘤，并且生長(zhǎng)速度無明顯差異。但與LLC-OVA-Mig相比，LLC-OVA-IKKβ在腫瘤形成過程中可發(fā)生免疫排斥，腫瘤縮小甚至消失。但在Rag2-/-基因缺陷鼠中上述差異消失，提示了淋巴細(xì)胞在腫瘤免疫排斥中的作用。Tetramer法顯示LLC-OVA-IKKβ小鼠外周血

4、OVA特異性的CD8+T細(xì)胞比例未增加，Elispot顯示LLC-OVA-IKKβ刺激小鼠T細(xì)胞分泌干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）的能力也未增加，只有腫瘤局部CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)增加。為了探索介導(dǎo)腫瘤局部T細(xì)胞浸潤(rùn)增加的機(jī)制，基因芯片分析LLC-OVA-Mig及LLC-OVA-IKKβ細(xì)胞基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)趨化因子配體2(chemokine(C-C motif) ligand2，ccl2)在LLC-OVA-IKKβ中表

5、達(dá)高于對(duì)照細(xì)胞，同時(shí)real time PCR及ELISA均驗(yàn)證了CCL2在LLC-OVA-IKKβ中的高表達(dá)。干擾LLC-OVA-IKKβ中CCL2的表達(dá)后，腫瘤在C57BL/6體內(nèi)生長(zhǎng)而不再出現(xiàn)免疫排斥，提示CCL2在趨化淋巴細(xì)胞至腫瘤局部發(fā)揮排斥腫瘤生長(zhǎng)的過程中有重要作用。
　　第三部分，構(gòu)建能夠激活NF-κB通路的其他重要分子的腺病毒表達(dá)載體，包括AdNIK、AdIRF3、AdIKKα、AdIKKβ及對(duì)照病毒載體AdGFP

6、，所有目的基因均為組成型活化狀態(tài)。首先驗(yàn)證了目的基因在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)，并且在TUBO乳腺癌細(xì)胞系內(nèi)可以激活下游相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá);其次利用所構(gòu)建的病毒載體皮下免疫Balb/c小鼠，僅細(xì)胞免疫反應(yīng)有短時(shí)間的增強(qiáng);但對(duì)于接種TUBO的小鼠，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，腫瘤內(nèi)注射AdIRF3后腫瘤生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，并且腫瘤局部浸潤(rùn)C(jī)D8+T細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞顯著增加，而Treg細(xì)胞比例在各組間無明顯差異。并且Elispot顯示AdIRF3組T細(xì)胞在接受