干擾素調(diào)節(jié)因子新剪接異構(gòu)體IRF7-e的結(jié)構(gòu)及功能.pdf

1、研究目的：
　　干擾素調(diào)節(jié)因子7（Interferon regulatory factor7，IRF7）是誘導(dǎo)I型干擾素表達(dá)的最主要的轉(zhuǎn)錄因子，尋找IRF7新的剪接異構(gòu)體，研究其結(jié)構(gòu)及功能，為探索IRF7參與調(diào)控I型干擾素機(jī)制的多樣性提供基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1、DNA提取、RNA提取與1st Strand cDNA的合成
　　提取293T細(xì)胞總DNA作為I型干擾素IFNα和IFNβ啟動(dòng)子擴(kuò)增的模板，并提取

2、Ploy(I:C)刺激后的293T細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成1st Strand cDNA，作為后續(xù)PCR擴(kuò)增的模板。
　　2、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）與Sanger測(cè)序
　　根據(jù)IRF7-a和IRF7-d開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物克隆到PMD-19T載體，隨機(jī)挑取100個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行Sanger測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)，保留含IRF7新剪接異構(gòu)體的克隆，提取質(zhì)粒

3、PMD-IRF7作為構(gòu)建表達(dá)載體的模板。
　　3、cDNA末端快速克隆（Rapid-amplification of cDNA ends，RACE）
　　通過 cDNA末端快速克隆獲取IRF7新剪接形式的完整轉(zhuǎn)錄本并克隆到PMD-19T載體中，Sanger測(cè)序確定其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)。
　　4、表達(dá)載體pCDNA3.1-His/A-IRF7-e與報(bào)告基因載體pGL3-IFNα/β的構(gòu)建
　　以Sanger測(cè)序

4、結(jié)果確定為IRF7新的剪接形式的質(zhì)粒（PMD-IRF7）為模板，擴(kuò)增IRF7新剪接異構(gòu)體的表達(dá)序列，并克隆至pCDNA3.1-His/A載體。以提取的293T細(xì)胞總DNA為模板構(gòu)建報(bào)告基因載體pGL3-IFNα/β。
　　5、雙熒光素酶報(bào)告分析檢測(cè)
　　轉(zhuǎn)染表達(dá)載體、報(bào)告基因載體以及作為內(nèi)參的pRL-TK質(zhì)粒至293T細(xì)胞，熒光素酶檢測(cè)試劑盒（Dual-Glo luciferase assay system）檢測(cè)，求出螢火蟲

5、熒光素酶/海腎熒光素酶數(shù)據(jù)比值，其平均數(shù)即為對(duì)應(yīng)熒光素酶活性數(shù)值。至少做三次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。
　　結(jié)果：
　　一、IRF7-e的克隆以及生物信息學(xué)分析
　　以IRF7-a-F/IRF7-a-R和IRF7-d-F/IRF7-d-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到的序列，克隆至PMD-19T載體，測(cè)序后生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了IRF7的一種新的剪接形式，命名為IRF7-e（GenBank：KC477210）。IRF7-e全長(zhǎng)為19

6、94 bp，包含長(zhǎng)為410 bp的5’非編碼區(qū)（Untranslated region，UTR）和120 bp的3’非編碼區(qū)，并在3’非編碼區(qū)包含有保守的PloyA信號(hào)序列AATAAA。IRF7-e的開放閱讀框?yàn)?464 bp，編碼487個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其等電點(diǎn)為6.659，蛋白分子量為52.8 kDa。IRF7的五種剪接形式都含有一個(gè)保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-binding domain， DBD），其中IRF7-e和IRF7-b

7、的蛋白質(zhì)序列相似度（Identity）最高，達(dá)到96%，與IRF7-d、IRF7-a和IRF7-c相似度分別為94%、90%、31%。IRF7-e基因組由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成，其基因組結(jié)構(gòu)與IRF7-d最為相似；與IRF7-d相比較，IRF7-e缺少第5個(gè)外顯子。
　　二、IRF7-e對(duì)I型干擾素基因IFNα和IFNβ啟動(dòng)子激活的分析
　　雙熒光素酶報(bào)告分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)IRF7-e可以顯著提高IFNα和IFNβ啟動(dòng)子

8、的活性，其中對(duì)IFNα啟動(dòng)子活性提高了12.18倍；對(duì)IFNβ的啟動(dòng)子活性提高了2.99倍，與對(duì)照組相比都具有顯著性差異（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1、本文發(fā)現(xiàn)了IRF7一種新的剪接異構(gòu)體形式，即IRF7-e，并通過RACE獲取RF7-e基因全長(zhǎng)。
　　2、雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)IRF7-e可以顯著地提高I型干擾素基因IFNα和IFNβ啟動(dòng)子的活性。由此可知，IRF7-e可能參與I型干擾素的調(diào)控。I