泛素連接酶Smurf1不同剪接異構(gòu)體的鑒定及功能研究.pdf

1、研究目的:鑒定Smurf1的兩種不同剪接異構(gòu)體，對其功能進行初步研究。
　　 研究方法:Western blotting檢測小鼠12種組織和9種細(xì)胞系中Smurf1(Smurf1 S和Smurf1 L)的蛋白質(zhì)表達水平，利用商品化的12種成人組織和10種人胚胎組織的cDNA文庫，PCR檢測兩種Smurf1異構(gòu)體在人體組織中的mRNA水平;間接免疫熒光法確定Smuff1在亞細(xì)胞中的定位;在人胚腎T細(xì)胞HEK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染Sm

2、urf1和Smad5檢驗Smurf1不同異構(gòu)體對底物降解的影響;免疫共沉淀實驗檢測兩種異構(gòu)體與Smad5/CKIP-1的相互作用;泛素化實驗檢測Smurf1兩種異構(gòu)體的自身泛素化。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、Smurf1 S在小鼠的心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、腦、子宮、膀胱、胰腺和骨骼肌組織中表達，而Smurf1 L則存在于小鼠的心、肝、肺、胃和骨骼肌中。Smurf1 S在HCT116+/+、HCT116-/-、M

3、CF-7、Hela、HEPG2、Chang、 HEK293T、U2Os、H1299細(xì)胞系中都有表達，而Smurf1 L在細(xì)胞系僅存在于HCT116+/+、Chang、 U2Os、H1299細(xì)胞系中。Smurf1 L在成人胃、腎和肺組織中高表達，在卵巢、骨骼肌、脊髓和乳腺中有少量表達。Smurf1 L在人胚心臟、胃、肺、脾和骨骼肌組織中高表達。
　　 2、Smurf1 S定位于H1299/HEK293T細(xì)胞胞質(zhì)中，而Smurf1

4、L定位于細(xì)胞膜上。且Smurf1 L在H1299細(xì)胞有絲分裂期定位于紡錘體上。
　　 3、隨著Smurf1 S表達量的升高，Smad5的蛋白質(zhì)水平呈明顯下調(diào);而隨著Smurf1 L表達量的升高，Smad5的蛋白質(zhì)水平呈現(xiàn)出一個先上升后下降的趨勢。
　　 4、Smurf1 S與Smad5的相互作用強于Smurf1 L與Smad5的相互作用，Smurf1 S與CKIP-1的相互作用也比Smurf1 L與CKIP-1強。

5、>　　 5、Smurf1 L的自身泛素化水平略高于Smurf1 S。
　　 研究結(jié)論:
　　 1、Smurf1的兩種異構(gòu)體在組織的表達分布不同，Smurf1 S存在于大多數(shù)組織中，而Smurf1 L只特異性存在于心、肺、胃和骨骼肌中。
　　 2、Smurf1 S與Smurf1 L的亞細(xì)胞定位完全不同，并且Smurf1 L定位于紡錘體中，其功能可能與細(xì)胞周期相關(guān)。
　　 3、Smurf1 L與Smurf1