人睪丸組織新的泛素連接酶TRIM69-HSD34的鑒定及功能研究.pdf

1、已知精子發(fā)生過程中許多細胞特異性和發(fā)育階段特異性蛋白質的合成和降解是依賴于泛素-蛋白酶體系統(tǒng)。本論文主要研究是從人睪丸組織發(fā)現(xiàn)一個新的E3泛素連接酶TRIM69,找到多個其泛素化修飾的蛋白,研究這些特異蛋白泛素化修飾后參與的細胞生理病理過程,間接了解TRIM69的功能,為下一步研究其在精子發(fā)生過程中的作用打好基礎。
　　 TRIM69是我們室從人睪丸cDNA文庫擴增得到的一個新基因,該基因編碼蛋白為TRIM69,它含有保守的RI

2、NG-Finger結構域,B-Box結構域,coiled-coil結構域,是TRIM/RBCC家族一名成員。文獻提示TRIM家族很多成員都具有E3泛素連接酶活性,是含有RING結構域的E3泛素連接酶。
　　 本室前期工作,一定程度上,表明TRIM69具有E3泛素連接酶活性,我們進一步通過體外泛素化試驗,證明TRIM69具有E3泛素連接酶活性。同時篩選到與TRIM69對應的E2泛素結合酶有UbcH2、UbcH6、UbcH5a、Ub

3、cH5c和UbcH13/Uevla。RING結構域的發(fā)生點突變和缺失時,TRIM69體外E3泛素連接酶活性明顯減弱,說明TRIM69的E3泛素連接酶的活性是依賴于完整的RING-finger結構域的,61位和64位的半胱氨酸是關鍵位點。另外,在一定范圍內,隨著反應時間增加,TRIM69的E3泛素連接酶的活性增加。體內泛素化試驗顯示當加入蛋白酶體抑制劑MG132,TRIM69自身泛素化條帶明顯增加,提示TRIM69自身泛素化修飾,也許是自

4、身水平調節(jié)的一種機制。
　　 細胞內免疫熒光實驗觀察GFP和Flag兩種不同標簽標記的TRIM69融合蛋白在細胞內定位和分布基本相同,都在細胞漿和細胞核呈聚集體和散在形式分布。
　　 為了深入研究TRIM69的功能,需要尋找其相互作用的蛋白質。我們室通過酵母雙雜交實驗,以N-端去除RING結構域(1-246bp)的序列作為誘餌基因,篩選到一個與TRIM69相互作用的蛋白HUS1。通過免疫沉淀和Pull down方法進一步

5、證明二者能夠相互作用。
　　 體內外泛素化試驗表明,TRIM69能夠促進HUS1的泛素化。穩(wěn)定性試驗顯示,TRIM69能夠促進HUS1降解,蛋白酶體抑制劑MG132能夠抑制該過程,說明TRIM69促HUS1降解是通過蛋白酶體途徑進行的。
　　 文獻提示JAB1(c-jun-activation-domain binding protein),即c-Jun結合蛋白,能夠介導9-1-1復合物通過蛋白酶體途徑降解,但文中沒有提

6、到參與該過程的E3泛素連接酶,既然TRIM69作為E3泛素連接酶能夠促進HUS1降解,那么可否假設,JAB1就是我們要尋找的橋接蛋白參與TRIM69降解HUS1過程呢?
　　 首先通過免疫沉淀試驗,證明了TRIM69,HUS1,JAB1三個蛋白質是可以形成復合物的。為了進一步驗證TRIM69與JAB1的關系,進行免疫沉淀和pull down試驗,結果表明,二者可以相互作用,TRIM69與JAB1相互作用部位集中于C端coiled

7、-coil和B30.2結構域。根據(jù)文獻,JAB1能夠介導HUS1降解,我們通過試驗,轉染不同劑量的JAB1,確證了過表達JAB1是能夠促進內源HUS1和Rad1蛋白降解,并且呈劑量依賴關系。
　　 TRIM69,JAB1以及HUS1之間可以建立聯(lián)系,為了進一步驗證JAB1是否起到橋接蛋白的作用,促內源HUS1降解,共轉染TRIM69和JAB1質粒,觀察內源HUS1的變化。實驗表明,單轉JAB1組能夠促進內源HUS1的降解,而共轉

8、TRIM69組,內源HUS1量有所增加,與之對應的是JAB1的表達量明顯減少,該結果提示,TRIM69能否通過調節(jié)JAB1水平進而調節(jié)HUS1水平呢?
　　 為了驗證該假設,首先需要確定TRIM69對JAB1水平的影響,JAB1穩(wěn)定性試驗表明TRIM69能夠加速外源轉染的JAB1降解,蛋白酶體抑制劑MG132能夠抑制該過程,說明TRIM69促JAB1降解是通過泛素蛋白酶體途徑進行的。體內泛素化試驗顯示TRIM69促進JAB1的泛

9、素化,當RING結構域發(fā)生點突變,促泛素化作用明顯減弱,說明TRIM69 E3泛素連接酶活性依賴于完整RING-finger結構域。
　　 已知JAB1與c-Jun結合形成穩(wěn)定復合物,激活AP-1信號通路,提高下游基因的表達。熒光報告素酶實驗以及WB分析結果顯示,TRIM69能夠降低AP-1通路活性,過表達TRIM69能夠降低外源轉染表達的JAB1,c-Jnn和磷酸化的c-Jun水平。已構建好穩(wěn)定表達TRIM69的質粒,后續(xù)實驗