人睪丸組織新的泛素連接酶TRIM69-HSD34的鑒定及功能研究.pdf

1、已知精子發(fā)生過(guò)程中許多細(xì)胞特異性和發(fā)育階段特異性蛋白質(zhì)的合成和降解是依賴于泛素-蛋白酶體系統(tǒng)。本論文主要研究是從人睪丸組織發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的E3泛素連接酶TRIM69,找到多個(gè)其泛素化修飾的蛋白,研究這些特異蛋白泛素化修飾后參與的細(xì)胞生理病理過(guò)程,間接了解TRIM69的功能,為下一步研究其在精子發(fā)生過(guò)程中的作用打好基礎(chǔ)。
　　 TRIM69是我們室從人睪丸cDNA文庫(kù)擴(kuò)增得到的一個(gè)新基因,該基因編碼蛋白為T(mén)RIM69,它含有保守的RI

2、NG-Finger結(jié)構(gòu)域,B-Box結(jié)構(gòu)域,coiled-coil結(jié)構(gòu)域,是TRIM/RBCC家族一名成員。文獻(xiàn)提示TRIM家族很多成員都具有E3泛素連接酶活性,是含有RING結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶。
　　 本室前期工作,一定程度上,表明TRIM69具有E3泛素連接酶活性,我們進(jìn)一步通過(guò)體外泛素化試驗(yàn),證明TRIM69具有E3泛素連接酶活性。同時(shí)篩選到與TRIM69對(duì)應(yīng)的E2泛素結(jié)合酶有UbcH2、UbcH6、UbcH5a、Ub

3、cH5c和UbcH13/Uevla。RING結(jié)構(gòu)域的發(fā)生點(diǎn)突變和缺失時(shí),TRIM69體外E3泛素連接酶活性明顯減弱,說(shuō)明TRIM69的E3泛素連接酶的活性是依賴于完整的RING-finger結(jié)構(gòu)域的,61位和64位的半胱氨酸是關(guān)鍵位點(diǎn)。另外,在一定范圍內(nèi),隨著反應(yīng)時(shí)間增加,TRIM69的E3泛素連接酶的活性增加。體內(nèi)泛素化試驗(yàn)顯示當(dāng)加入蛋白酶體抑制劑MG132,TRIM69自身泛素化條帶明顯增加,提示TRIM69自身泛素化修飾,也許是自

4、身水平調(diào)節(jié)的一種機(jī)制。
　　 細(xì)胞內(nèi)免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察GFP和Flag兩種不同標(biāo)簽標(biāo)記的TRIM69融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位和分布基本相同,都在細(xì)胞漿和細(xì)胞核呈聚集體和散在形式分布。
　　 為了深入研究TRIM69的功能,需要尋找其相互作用的蛋白質(zhì)。我們室通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn),以N-端去除RING結(jié)構(gòu)域(1-246bp)的序列作為誘餌基因,篩選到一個(gè)與TRIM69相互作用的蛋白HUS1。通過(guò)免疫沉淀和Pull down方法進(jìn)一步

5、證明二者能夠相互作用。
　　 體內(nèi)外泛素化試驗(yàn)表明,TRIM69能夠促進(jìn)HUS1的泛素化。穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示,TRIM69能夠促進(jìn)HUS1降解,蛋白酶體抑制劑MG132能夠抑制該過(guò)程,說(shuō)明TRIM69促HUS1降解是通過(guò)蛋白酶體途徑進(jìn)行的。
　　 文獻(xiàn)提示JAB1(c-jun-activation-domain binding protein),即c-Jun結(jié)合蛋白,能夠介導(dǎo)9-1-1復(fù)合物通過(guò)蛋白酶體途徑降解,但文中沒(méi)有提

6、到參與該過(guò)程的E3泛素連接酶,既然TRIM69作為E3泛素連接酶能夠促進(jìn)HUS1降解,那么可否假設(shè),JAB1就是我們要尋找的橋接蛋白參與TRIM69降解HUS1過(guò)程呢?
　　 首先通過(guò)免疫沉淀試驗(yàn),證明了TRIM69,HUS1,JAB1三個(gè)蛋白質(zhì)是可以形成復(fù)合物的。為了進(jìn)一步驗(yàn)證TRIM69與JAB1的關(guān)系,進(jìn)行免疫沉淀和pull down試驗(yàn),結(jié)果表明,二者可以相互作用,TRIM69與JAB1相互作用部位集中于C端coiled

7、-coil和B30.2結(jié)構(gòu)域。根據(jù)文獻(xiàn),JAB1能夠介導(dǎo)HUS1降解,我們通過(guò)試驗(yàn),轉(zhuǎn)染不同劑量的JAB1,確證了過(guò)表達(dá)JAB1是能夠促進(jìn)內(nèi)源HUS1和Rad1蛋白降解,并且呈劑量依賴關(guān)系。
　　 TRIM69,JAB1以及HUS1之間可以建立聯(lián)系,為了進(jìn)一步驗(yàn)證JAB1是否起到橋接蛋白的作用,促內(nèi)源HUS1降解,共轉(zhuǎn)染TRIM69和JAB1質(zhì)粒,觀察內(nèi)源HUS1的變化。實(shí)驗(yàn)表明,單轉(zhuǎn)JAB1組能夠促進(jìn)內(nèi)源HUS1的降解,而共轉(zhuǎn)

8、TRIM69組,內(nèi)源HUS1量有所增加,與之對(duì)應(yīng)的是JAB1的表達(dá)量明顯減少,該結(jié)果提示,TRIM69能否通過(guò)調(diào)節(jié)JAB1水平進(jìn)而調(diào)節(jié)HUS1水平呢?
　　 為了驗(yàn)證該假設(shè),首先需要確定TRIM69對(duì)JAB1水平的影響,JAB1穩(wěn)定性試驗(yàn)表明TRIM69能夠加速外源轉(zhuǎn)染的JAB1降解,蛋白酶體抑制劑MG132能夠抑制該過(guò)程,說(shuō)明TRIM69促JAB1降解是通過(guò)泛素蛋白酶體途徑進(jìn)行的。體內(nèi)泛素化試驗(yàn)顯示TRIM69促進(jìn)JAB1的泛

9、素化,當(dāng)RING結(jié)構(gòu)域發(fā)生點(diǎn)突變,促泛素化作用明顯減弱,說(shuō)明TRIM69 E3泛素連接酶活性依賴于完整RING-finger結(jié)構(gòu)域。
　　 已知JAB1與c-Jun結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合物,激活A(yù)P-1信號(hào)通路,提高下游基因的表達(dá)。熒光報(bào)告素酶實(shí)驗(yàn)以及WB分析結(jié)果顯示,TRIM69能夠降低AP-1通路活性,過(guò)表達(dá)TRIM69能夠降低外源轉(zhuǎn)染表達(dá)的JAB1,c-Jnn和磷酸化的c-Jun水平。已構(gòu)建好穩(wěn)定表達(dá)TRIM69的質(zhì)粒,后續(xù)實(shí)驗(yàn)