泛素連接酶RNF6在惡性血液腫瘤中的功能及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：RNF6在惡性血液腫瘤中功能的初步分析
　　目的：目前，環(huán)指蛋白R(shí)NF6在惡性血液腫瘤中的功能及其分子機(jī)制尚未報(bào)道。本項(xiàng)目首先檢測(cè)了RNF6在多發(fā)性骨髓瘤和白血病病人樣本以及細(xì)胞株中的表達(dá)情況，并利用慢病毒過(guò)表達(dá)系統(tǒng)和shRNA干擾技術(shù)分析RNF6在多發(fā)性骨髓瘤和白血病細(xì)胞中的作用，以期闡述RNF6在惡性血液腫瘤中的相關(guān)功能。
　　方法：
　　(1)通過(guò)q-RT-PCR和RT-PCR方法檢測(cè)了病人樣本以及正常

2、骨髓（NBM）樣本中RNF6的mRNA表達(dá)水平；
　　(2)利用Immunoblotting技術(shù)檢測(cè)了RNF6在6種多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株（H929、KMS11、LP1、OCI-My5、OPM2和RPMI-8226）以及7種白血病細(xì)胞株（AML2、HL60、NB4、THP1、K562、Jurkat和697）中的表達(dá)豐度；
　　(3)通過(guò)生長(zhǎng)曲線和集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)RNF6對(duì)白血病細(xì)胞增殖以及集落形成能力的影響；
　　(

3、4)利用shRNA干擾技術(shù)檢測(cè)沉默RNF6對(duì)白血病細(xì)胞增殖的影響；
　　(5)通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法檢測(cè)白血病細(xì)胞中過(guò)表達(dá)RNF6對(duì)硼替佐米敏感性的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)采用q-RT-PCR和RT-PCR對(duì)病人樣本和正常骨髓樣本中RNF6的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)RNF6的mRNA水平在惡性血液病病人樣本中存在高表達(dá)；
　　(2)與正常骨髓樣本相比，RNF6在多發(fā)性骨髓瘤和白血病細(xì)胞株中蛋白質(zhì)水平比較高；

4、　　(3)生長(zhǎng)曲線和集落生成實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)RNF6能夠顯著促進(jìn)白血病細(xì)胞生長(zhǎng)和集落形成能力；
　　(4) shRNA沉默RNF6能夠明顯抑制白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)；
　　(5)利用慢病毒介導(dǎo) RNF6，使之在白血病細(xì)胞中高表達(dá)，可以顯著減弱 K562對(duì)硼替佐米的藥物敏感性。
　　小結(jié)：
　　RNF6在多種多發(fā)性骨髓瘤和白血病的病人樣本和細(xì)胞株中均存在異常高表達(dá)。同時(shí)，過(guò)表達(dá)或者沉默RNF6以后，都能顯著地促進(jìn)或者抑制

5、癌細(xì)胞增殖。以上這些結(jié)果表明，RNF6可能與惡性血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。另外，過(guò)表達(dá)RNF6可以減弱K562細(xì)胞對(duì)硼替佐米的藥物敏感性，這提示，RNF6還可能與癌細(xì)胞的耐藥性相關(guān)。
　　第二部分：5AHQ對(duì)RNF6的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制分析
　　目的：已有研究發(fā)現(xiàn)，喹啉類似物5AHQ具有很強(qiáng)的抗多發(fā)性骨髓瘤和抗白血病活性。同時(shí)，前期通過(guò)DNA Microarray發(fā)現(xiàn)，5AHQ可以顯著影響RNF6的mRNA水平。本項(xiàng)目將進(jìn)一步闡

6、述RNF6的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，從而進(jìn)一步揭示5AHQ抗腫瘤的相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法:
　　(1)多發(fā)性骨髓瘤和白血病細(xì)胞株經(jīng)5AHQ加藥處理24小時(shí)后，利用MTT法檢測(cè)藥物的細(xì)胞毒活性；
　　(2)5AHQ分別處理多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株（OCI-My5和RPMI-8226）和白血病細(xì)胞株（AML2和K562）24小時(shí)后，提取細(xì)胞總蛋白和總RNA，分別經(jīng)Immunoblotting或者RT-PCR檢測(cè)RNF6的蛋白或mRNA水

7、平；
　　(3) UCSC網(wǎng)站預(yù)測(cè)RNF6的啟動(dòng)子序列，并構(gòu)建RNF6的啟動(dòng)子截?cái)囿w，然后利用熒光素酶雙基因報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)RNF6啟動(dòng)子截?cái)囿w的熒光素酶活性；
　　(4)利用TFSearch軟件預(yù)測(cè)RNF6核心啟動(dòng)子上可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并對(duì)其進(jìn)行點(diǎn)突變和缺失突變，檢測(cè)預(yù)測(cè)位點(diǎn)對(duì)啟動(dòng)子活性的影響；
　　(5)利用CHIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Pbx1與RNF6啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合情況；
　　(6)利用熒光素酶雙基因報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)P

8、bx1/Prep1/MEIS1對(duì)RNF6啟動(dòng)子活性的影響；
　　(7)利用Co-IP檢測(cè)5AHQ對(duì)Pbx1/Prep1異源二聚體形成的影響；同時(shí)利用熒光素酶雙基因報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)5AHQ對(duì)RNF6核心啟動(dòng)子活性的影響。
　　結(jié)果：
　　(1) MTT結(jié)果顯示，5AHQ能夠顯著抑制多發(fā)性骨髓瘤和白血病細(xì)胞的存活；
　　(2)5AHQ分別處理骨髓瘤和白血病細(xì)胞株后，RNF6的mRNA和蛋白水平均顯著下調(diào)，這說(shuō)明5AHQ可

9、以下調(diào)RNF6的轉(zhuǎn)錄并抑制其蛋白的表達(dá)；
　　(3)通過(guò)缺失突變分析發(fā)現(xiàn)，-365/-99是RNF6的核心啟動(dòng)子區(qū)域，具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性；
　　(4)利用定點(diǎn)突變和缺失突變技術(shù)發(fā)現(xiàn)，RNF6核心啟動(dòng)子區(qū)域中的Pbx1結(jié)合位點(diǎn)能夠顯著調(diào)控RNF6的啟動(dòng)子活性；
　　(5) CHIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Pbx1可以和RNF6啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合；
　　(6)當(dāng)單轉(zhuǎn)染Pbx1時(shí)，并不能顯著上調(diào)RNF6的啟動(dòng)子活性，而當(dāng)Pbx1與P

10、rep1共轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)，可以顯著上調(diào) RNF6的啟動(dòng)子活性，這說(shuō)明，Pbx1需要形成異源二聚體后才能調(diào)控RNF6的轉(zhuǎn)錄；
　　(7)5AHQ可以顯著抑制Pbx1/Prep1異源二聚體的形成，以及明顯下調(diào)RNF6核心啟動(dòng)子的活性。
　　小結(jié)：
　　進(jìn)一步證實(shí)了5AHQ可以顯著抑制骨髓瘤和白血病細(xì)胞存活，并且可以通過(guò)抑制Pbx1/Prep1異源二聚體的形成來(lái)調(diào)控RNF6的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。其中也發(fā)現(xiàn)，-365/-99為RNF6的核心

11、啟動(dòng)子，Pbx1轉(zhuǎn)錄因子可以介導(dǎo)RNF6的轉(zhuǎn)錄。
　　第三部分：RNF6泛素化特點(diǎn)的分析
　　目的:RNF6屬于環(huán)指蛋白家族，環(huán)指蛋白家族成員一般都可以發(fā)生自身泛素化。本部分將考察 RNF6的泛素化情況并尋找其特異性泛素化位點(diǎn)，從而進(jìn)一步揭示RNF6的泛素化機(jī)制。
　　方法：
　　(1)分別加入溶酶體抑制劑（NH4Cl和Chloroquine）以及蛋白酶體抑制劑（MG132和Lactacystin）考察RNF6通

12、過(guò)何種方式發(fā)生降解；
　　(2)利用免疫共沉淀方法（Co-IP）檢測(cè)RNF6的泛素化情況；
　　(3)通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)（Lysine突變成Arginine）構(gòu)建RNF6一系列單點(diǎn)突變體、三點(diǎn)突變體和四點(diǎn)突變體，然后通過(guò)MG132處理分析這些突變體的泛素化降解情況；
　　(4)通過(guò)CHX Chase實(shí)驗(yàn)檢測(cè)WT，K0，K608和K608R蛋白的半衰期；
　　(5)通過(guò)轉(zhuǎn)染一系列不同的去泛素化酶，檢測(cè)RNF6的去泛素

13、化情況。
　　結(jié)果：
　　(1)蛋白酶體抑制劑MG132和Lactacystin能夠顯著聚集RNF6蛋白，而溶酶體抑制劑NH4Cl和Chloroquine并不能影響RNF6蛋白量，這提示RNF6主要通過(guò)蛋白酶體途徑進(jìn)行降解；
　　(2)通過(guò) Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RNF6蛋白能夠形成顯著的多聚泛素鏈，同時(shí)加入蛋白酶體抑制劑后，RNF6蛋白的多聚泛素鏈明顯增多，這說(shuō)明RNF6蛋白能夠發(fā)生多聚泛素化；
　　(3)通過(guò)點(diǎn)

14、突變分析發(fā)現(xiàn)，RNF6中第608位賴氨酸位點(diǎn)發(fā)生突變后，能夠明顯阻斷RNF6的泛素-蛋白酶體降解，表明K608為RNF6的重要泛素化位點(diǎn)。但是K0（Lysine-free）依然能夠發(fā)生一定程度的泛素化，這說(shuō)明除了賴氨酸位點(diǎn)外，可能還存在其它的氨基酸位點(diǎn)介導(dǎo)RNF6的泛素化，如半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等；
　　(4) CHX Chase實(shí)驗(yàn)表明，K608R顯著延長(zhǎng)了RNF6蛋白的半衰期；
　　(5)通過(guò)共轉(zhuǎn)染一系列去泛素化酶質(zhì)

15、粒發(fā)現(xiàn)，某些DUBs可以明顯上調(diào)RNF6的表達(dá)水平，其中 USP22得到了進(jìn)一步的論證。
　　小結(jié)：
　　環(huán)指蛋白R(shí)NF6主要通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑進(jìn)行降解。同時(shí)，RNF6能夠發(fā)生多聚泛素化，其中K608為RNF6的重要泛素化位點(diǎn)。另外通過(guò)去泛素化酶篩選發(fā)現(xiàn)，USP22可能為RNF6的去泛素化酶。
　　第四部分：RNF6促進(jìn)GR的泛素化并增強(qiáng)其穩(wěn)定性
　　目的:近期有研究發(fā)現(xiàn)，RNF6作為E3（泛素連接酶）可以介

16、導(dǎo)雄激素受體AR發(fā)生非典型泛素化而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。但在血液病細(xì)胞中的機(jī)制還不清楚。據(jù)此，本項(xiàng)目將探索RNF6是否能夠影響多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中糖皮質(zhì)激素受體GR的相關(guān)功能，從而更進(jìn)一步闡述RNF6在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法：
　　(1)通過(guò)Immunoblotting檢測(cè)骨髓瘤和白血病細(xì)胞株中GR和RNF6的蛋白表達(dá)豐度，并檢測(cè)骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)5AHQ處理后GR和RNF6的蛋白表達(dá)趨勢(shì)；
　　(2)通過(guò)質(zhì)

17、粒共轉(zhuǎn)染方法研究RNF6對(duì)GR蛋白表達(dá)的影響；
　　(3) CHX chase實(shí)驗(yàn)考察RNF6對(duì)GR蛋白半衰期的影響；
　　(4) Co-IP分析RNF6與GR是否存在相互作用；
　　(5)利用缺失突變技術(shù)構(gòu)建一系列RNF6與GR的截?cái)囿w，再通過(guò)Co-IP實(shí)驗(yàn)分析RNF6與GR在哪一區(qū)域發(fā)生相互作用；
　　(6)通過(guò)Co-IP分析RNF6能否介導(dǎo)GR發(fā)生泛素化；
　　(7)使用地塞米松（Dex）或MG132

18、處理分析RNF6對(duì)Dex誘導(dǎo)的GR降解的影響。
　　結(jié)果：
　　(1) RNF6和GR的蛋白表達(dá)豐度基本一致，而且不同骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)5AHQ處理后發(fā)現(xiàn)，GR和RNF6蛋白表達(dá)趨勢(shì)一致，這暗示RNF6與GR可能存在一定的關(guān)聯(lián)性；
　　(2) RNF6能夠上調(diào)外源性和內(nèi)源性GR蛋白水平，而GR的mRNA水平并沒(méi)有發(fā)生變化，這提示RNF6通過(guò)影響GR的翻譯后修飾上調(diào)GR蛋白水平；
　　(3)通過(guò)CHX chase實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)

19、，RNF6能夠延長(zhǎng)GR蛋白的半衰期；
　　(4) Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RNF6與GR存在相互作用關(guān)系；
　　(5)缺失突變分析發(fā)現(xiàn)，GR蛋白的531-777區(qū)域與RNF6發(fā)生結(jié)合，RNF6蛋白的87-482區(qū)域與GR發(fā)生結(jié)合；
　　(6)通過(guò)Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RNF6能夠促進(jìn)GR發(fā)生非降解型的多聚泛素化，即非典型泛素化；
　　(7) RNF6能夠抑制Dex介導(dǎo)的GR蛋白降解。
　　小結(jié)：
　　RNF

20、6與GR存在相互作用，并且RNF6結(jié)合在GR的LBD結(jié)構(gòu)域區(qū)域。另外，RNF6作為E3泛素連接酶，能夠促進(jìn)GR發(fā)生非典型泛素化而導(dǎo)致其發(fā)生穩(wěn)定。同時(shí)，RNF6能夠抑制地塞米松所誘導(dǎo)的GR的降解。
　　結(jié)論：
　　本研究首先分析了RNF6在多發(fā)性骨髓瘤和白血病病人樣本和細(xì)胞株中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)RNF6存在高表達(dá)。另外，通過(guò)慢病毒過(guò)表達(dá)和干擾系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，RNF6能夠影響K562細(xì)胞的增殖以及對(duì)硼替佐米的敏感性，以上這些結(jié)果表明

21、RNF6可能與惡性血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，抗血液腫瘤化合物5AHQ能夠影響RNF6的轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步對(duì)RNF6的啟動(dòng)子區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)，-365/-99為RNF6的核心啟動(dòng)子區(qū)域，同時(shí)轉(zhuǎn)錄因子Pbx1與TALE家族蛋白如Prep1等形成異源二聚體后，能夠調(diào)控RNF6的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。而且，5AHQ可以通過(guò)抑制Pbx1與Prep1的異源二聚化，從而抑制RNF6啟動(dòng)子的活化。另外，由于RNF6為環(huán)指家族蛋白，能夠發(fā)生自身泛素化，并主要通過(guò)泛

22、素-蛋白酶體途徑進(jìn)行降解。同時(shí)也對(duì) RNF6的泛素化位點(diǎn)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)RNF6中的賴氨酸位點(diǎn)K608發(fā)生突變后，可以顯著抑制RNF6的泛素化降解，這提示K608為RNF6的重要泛素化位點(diǎn)。然而，K0(Lysine-free)仍然能夠發(fā)生一定程度的泛素化，這表明除了賴氨酸位點(diǎn)外，還存在其它泛素化位點(diǎn)介導(dǎo)RNF6的泛素化，如半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等。另外，通過(guò)探索RNF6與多發(fā)性骨髓瘤中GR的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，RNF6與GR能夠發(fā)生結(jié)合，并且R