ACC在腫瘤代謝中的功能及其機制研究.pdf

1、背景：
　　腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）與乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl-CoA Carboxylase,ACC）作為其各自代謝調節(jié)過程中的關鍵環(huán)節(jié)，相互之間存在密切聯(lián)系，形成細胞內的上游和下游的信號通路。AMPK是機體和細胞能量代謝的調節(jié)器，當細胞內 ATP水平下降時，細胞處于能量應激狀態(tài)下，AMPK激活，為細胞提供能量[1]。ACC是存在于胞漿中含有生物素的變構羧化

2、酶，是脂肪酸代謝過程中的限速酶，其使乙酰輔酶A羧化成丙二酰輔酶A。在人類ACC有兩種亞型，ACC1和ACC2。近年來發(fā)現(xiàn)腫瘤代謝在腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉移和耐藥過程中起著重要的作用[2]，而AMPK和ACC在腫瘤代謝中發(fā)揮著核心作用。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)，一種表皮生長因子受體阻斷抗體，西妥昔單抗可以抑制腫瘤代謝并且可以在腫瘤細胞中逆轉Warburg效應（腫瘤有氧糖酵解）[3]。我們同樣發(fā)現(xiàn)AMPK的短暫激活在應用西妥昔單抗治療腫瘤細胞的

3、早期是一項重要指標，但長期且持續(xù)激活的AMPK水平是腫瘤耐藥的一種機制[4]。與西妥昔單抗治療前的頭頸鱗癌比較，治療后組織及細胞高表達磷酸化AMPK、磷酸化ACC及ACC。我們設計本實驗，進一步明確ACC在頭頸鱗癌組織及細胞中的表達方式；從臨床水平、細胞水平及動物實驗水平探索 ACC在腫瘤代謝過程中功能及其分子調控機制。
　　方法：
　　1.應用分子克隆方法構建乏氧誘導因子-1α（Hypoxia inducible fact

4、or-1α, HIF-1α）與乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl-CoA Carboxylase,ACC）過表達質粒，構建慢病毒穩(wěn)定轉染系統(tǒng)，建立穩(wěn)定過表達 HIF-1α的 HEK293_HIF-1α細胞系；用Western blot，葡萄糖消耗實驗（Glucose consumption assay）檢測所構建穩(wěn)系HEK293_HIF-1α的表達水平及其對于葡萄糖的消耗水平。
　　2.應用分子克隆方法構建乙酰輔酶A羧化酶（Acety

5、l-CoA Carboxylase, ACC），ACC1_S79A及ACC2_S212A過表達質粒,構建慢病毒穩(wěn)定轉染系統(tǒng)，建立穩(wěn)定過表達的ACC1_S79A和ACC2_S212A的HEK293_HIF-1α細胞系；用Western blot，細胞生存死亡實驗（Live/dead cell viability assay）檢測AMPK、ACC及其磷酸化蛋白的表達水平，檢測在能量應激狀況下（低糖）不同穩(wěn)轉細胞的存活率。
　　3.應用

6、Western blot、MTT檢測不同頭頸鱗癌細胞系代謝相關指標及對西妥昔單抗敏感性。應用RT-RCR檢測不同細胞系ACC1和ACC2mRNA水平。應用放線菌酮（Cycloheximide, CHX）抑制蛋白合成，檢測ACC降解水平。
　　4.應用ACC1_S79A及ACC2_S212A過表達質粒及ACC1、ACC2小干擾RNA（siRNA）轉染頭頸鱗癌細胞系；用Western blot、細胞生存死亡實驗（Live/dead c

7、ell viability assay）、細胞增殖實驗（Cell proliferation assay）、凋亡實驗（Apoptosis assay）檢測腫瘤細胞經(jīng)過西妥昔單抗治療前后AMPK、ACC及其磷酸化蛋白的表達水平及細胞存活率，細胞凋亡狀況。
　　5.應用 ACC及脂肪酸合成抑制劑5-十四烷氧基-2-呋喃甲酸(5-Tetradecyloxy-2-furoic acid,TOFA)抑制ACC，通過Western blot、

8、流式細胞技術、細胞增殖實驗（MTT）、凋亡實驗（Apoptosis assay）檢測TOFA對西妥昔單抗耐藥頭頸鱗癌細胞系的作用。
　　6.構建裸鼠（Nude Mouse）皮下移植瘤模型，應用TOFA，檢測腫瘤的增殖情況，并通過熒光成像（Luciferase image）和免疫組織化學的方法，探討磷酸化AMPK、磷酸化ACC及ACC的表達與西妥昔單抗治療的相關性。
　　7.搜集頭頸鱗癌組織石蠟標本資料進行回顧性研究， AMP

9、K-T172p, ACC-S79p和ACC的表達表達水平與西妥昔單抗治療的相關性。
　　結果：
　　1.轉染HIF-1α使HEK293細胞腫瘤化特征。予以正常胚胎腎細胞HEK293細胞系過表達HIF-1α_P402A/P564A和HIF-1α_?ODD后，發(fā)現(xiàn)轉染HIF-1α的HEK293細胞對于葡萄糖的消耗明顯增加（由于Warberg效應），同時伴隨AMPK的激活（表現(xiàn)為AMPK T172磷酸化的增加）和ACC的抑制（表現(xiàn)

10、為ACC S79磷酸化的增加）。轉染HIF-1α的HEK293細胞對于低糖環(huán)境更敏感。
　　2.能量應激(低糖)狀況下 ACC表現(xiàn)出對細胞重要的保護功能。過表達的ACC1_S79A和ACC2_S212A對于AMPK的激活沒有作用，對于低糖所導致的內源性的ACC的抑制沒有作用，這表明ACC可以保護低糖環(huán)境中的細胞存活是不由AMPK的激活所介導的。而且，敲除內源性ACC1和ACC2，特別是ACC1導致了在低糖環(huán)境下更多的HEK293和

11、HEK293 HIF-1α_P402A/P564A細胞的死亡。在HEK293 HIF-1α_P402A/P564A細胞中敲除ACC1，16小時后約80％細胞死亡。
　　3.磷酸化AMPK和磷酸化ACC的表達水平與頭頸鱗癌細胞對西妥昔單抗的耐藥相關。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)西妥昔單抗可通過下調HIF-1α和抑制HIF-1α調節(jié)的糖酵解來激活AMPK并且抑制HNSCC細胞的增殖。進一步發(fā)現(xiàn)高表達的磷酸化AMPK T172和磷酸化ACC S7

12、9與頭頸鱗癌細胞系對西妥昔單抗的敏感性呈負相關。這個結果同樣在獲得性耐藥西妥昔單抗的兩對等基因細胞中HN5/HN5-R和 FaDu/FaDu-R中得到證實。進一步發(fā)現(xiàn)穩(wěn)轉 HN5 HIF-1α_P402A/P564A細胞激活AMPK抑制ACC，對西妥昔單抗耐藥。
　　4. ACC的表達水平與西妥昔單抗耐藥相關。RT-PCR的結果顯示增加的ACC不是由于轉錄水平的增加引起的，經(jīng)過西妥昔單抗治療后， HN5細胞中SREBP-1c下降明

13、顯，而HN5-R細胞中SREBP-1c無明顯變化，相似的結果在另外兩種耐藥細胞UMSCC1和MDA1986中得到證實。ACC在HN5-R中明顯比在 HN5中更加穩(wěn)定，代謝減慢，預示著一種轉錄后機制是 ACC升高的原因。應用siRNA技術在HN5中敲除內源性ACC1和ACC2并沒有影響西妥昔單抗治療后凋亡的水平，而在兩種耐藥細胞HN5-R和UMSCC1中，可以看到明顯的凋亡增加。
　　5.西妥昔單抗耐藥細胞對于TOFA更敏感，包括獲

14、得性耐藥的HN5-R，天然耐藥的 UMSCC1和 MDA1986。而且長期慢性暴露于 TOFA治療的UMSCC1-TOFA耐藥細胞逆轉為對西妥昔單抗敏感。 TOFA與西妥昔單抗和用能明顯的引起耐藥細胞HN5-R、UMSCC1和 MDA1986的凋亡，聯(lián)合用藥效果明顯。
　　6.體內動物實驗證實聯(lián)合用藥對于西妥昔單抗耐藥細胞有明顯的效果。我們通過測量腫瘤的大小和IVIS腫瘤成像測量。應用TOFA治療沒有使裸鼠體重下降。免疫組化證實經(jīng)

15、西妥昔單抗治療腫瘤組織磷酸化AMPK T172、磷酸化ACC S79和ACC與對照未治療組增加，聯(lián)合用藥組免疫組化結果與體外細胞實驗相符，應用UMSCC1細胞同樣得到證實。
　　7.我們收集了18例頭頸鱗癌患者，其中6例經(jīng)過化療+西妥昔單抗治療后手術，剩余18例為對照化療后手術。其中第六例患者為化療后手術，復發(fā)后給予化療+西妥昔單抗治療后再次手術。以第六例患者為例，可以明顯發(fā)現(xiàn)經(jīng)過西妥昔單抗治療后，磷酸化AMPK T172、磷酸化