RhoA在缺氧誘導(dǎo)的乳腺癌新生血管形成中的功能及其機(jī)制研究.pdf

1、乳腺癌是全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。由于乳腺癌細(xì)胞異常的增殖能力，遠(yuǎn)處臟器的轉(zhuǎn)移能力，以及對(duì)現(xiàn)有治療藥物的抵抗能力，使其成為嚴(yán)重危害女性健康的“頭號(hào)殺手”。盡管乳腺癌的早期診斷、治療手段和預(yù)后檢測(cè)水平不斷提高，但是乳腺癌患者的死亡率仍舊得不到有效的控制?？寡苌芍委熥鳛橐环N腫瘤生物治療手段越來越受到重視，它不僅可以切斷腫瘤原發(fā)灶的營(yíng)養(yǎng)供給，而且可以通過抑制新生血管的生成而控制腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。但是，目前有關(guān)腫瘤新生血管的研究相對(duì)較少，

2、其分子機(jī)制還不完全清楚，尋找到血管生成通路上游的開關(guān)分子意義重大。
　　RhoA作為小G蛋白家族中的一員，參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲、增殖、凋亡和周期調(diào)控等多個(gè)環(huán)節(jié)，并且扮演著眾多信號(hào)通路分子開關(guān)的角色。然而，有關(guān)RhoA在腫瘤新生血管中的作用機(jī)制尚無明確的定論。缺氧作為一種應(yīng)激因素，貫穿于腫瘤發(fā)生發(fā)展的全過程。缺氧不僅可以影響腫瘤相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而且為新生血管的發(fā)生提供了“溫床”。那么，RhoA是否在缺氧誘導(dǎo)的腫瘤新生血管中發(fā)揮

3、作用呢？我們能否從RhoA入手去調(diào)控血管生成的信號(hào)通路呢？帶著這樣的疑問，我們進(jìn)行了RhoA在缺氧誘導(dǎo)的乳腺癌新生血管形成中的功能及其機(jī)制的研究。
　　研究方法和結(jié)果：
　　1、RhoA在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)分析及對(duì)腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響：（1）通過RT-PCR和westernblot分別檢測(cè)七株乳腺癌細(xì)胞系中RhoA的表達(dá)情況；（2）轉(zhuǎn)染針對(duì)人RhoA的小干擾RNA，westernblot和RT-PCR驗(yàn)證其干涉效率

4、；（3）通過MTT實(shí)驗(yàn)、單層細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期和凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)觀察siRhoA對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞周期和凋亡的影響；（4）通過裸鼠移植瘤內(nèi)注射siRhoA實(shí)驗(yàn)和免疫組化分析，觀察siRhoA對(duì)移植瘤生長(zhǎng)和VEGF表達(dá)的影響。結(jié)果：RhoA在乳腺癌細(xì)胞系中差異性表達(dá)，這種表達(dá)的差異性與細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力有關(guān)；siRhoA能夠有效地逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，并且體外瘤內(nèi)注射同樣能夠發(fā)揮抑瘤和抑制血管的作用。
　　2、

5、RhoA在缺氧誘導(dǎo)的乳腺癌新生血管形成中的生物功能分析：（1）ELISA檢測(cè)缺氧條件下，MCF-7細(xì)胞中RhoA對(duì)VEGF分泌水平的影響；（2）建立MCF-7/HUVEC共培養(yǎng)模型，觀察在缺氧刺激下，MCF-7細(xì)胞中RhoA活性的變化對(duì)HUVEC增殖、遷移、管腔和F-actin形成的影響。結(jié)果：缺氧條件下，活性RhoA可以促進(jìn)MCF-7細(xì)胞VEGF的分泌，沉默RhoA可以抑制VEGF的分泌；在共培養(yǎng)模型中，當(dāng)MCF-7細(xì)胞中RhoA活化

6、時(shí)，可以促進(jìn)HUVEC增殖、遷移、管腔和F-actin的形成，而MCF-7細(xì)胞中RhoA沉默時(shí)，則HUVEC的上述生物學(xué)行為受到抑制。
　　3、RhoA在缺氧誘導(dǎo)的乳腺癌新生血管形成中的分子機(jī)制研究：（1）westernblot檢測(cè)缺氧對(duì)RhoA、p53、HIF-1α和VEGF蛋白水平的影響及RhoA對(duì)這三個(gè)分子的調(diào)控作用；（2）共聚焦顯微鏡觀察缺氧情況下RhoA對(duì)p53核轉(zhuǎn)位的影響；（3）westernblot和免疫共沉淀檢測(cè)R

7、hoA調(diào)控p53的信號(hào)通路。結(jié)果：缺氧可以抑制p53的表達(dá)，促進(jìn)RhoA、HIF-1α和VEGF的表達(dá)；RhoA激活后能夠抑制p53的表達(dá)，促進(jìn)HIF-1α和VEGF的表達(dá)，而RhoA沉默后能夠上調(diào)p53的表達(dá)，下調(diào)HIF-1α和VEGF的表達(dá)；缺氧條件下，RhoA的活化可以促進(jìn)p53的入核，而沉默RhoA則p53的入核作用明顯減弱；Akt/MDM2和泛素-蛋白酶體通路可能參與了RhoA對(duì)缺氧誘導(dǎo)腫瘤血管生成的分子機(jī)制中。
　　結(jié)

8、論：（1）RhoA在七株乳腺癌細(xì)胞系中差異性表達(dá)，這可能與細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力有關(guān)；（2）siRhoA可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，移植瘤內(nèi)注射可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)和VEGF的表達(dá)；（3）在缺氧刺激下，RhoA可能通過調(diào)控VEGF的表達(dá)水平，間接地影響HUVEC細(xì)胞的增殖、遷移、管腔和F-actin形成能力，從而參與腫瘤新生血管的形成過程中；（4）缺氧條件下，RhoA通過對(duì)血管抑制因子p53的調(diào)節(jié)來影響血管生成因子HIF-1α和VEGF