三苯氧胺在乳腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　研究三苯氧胺對乳腺癌細(xì)胞MCF-7生長及其放射敏感性的影響，探討三苯氧胺對BTG1基因的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)乳腺癌新的治療靶點(diǎn)。
　　方法：
　　選用人乳腺癌MCF-7(ER+)、MDA-MB-435(ER-)細(xì)胞系作為研究對象。
　　(1)采用CCK-8法檢測三苯氧胺對乳腺癌細(xì)胞MCF-7(ER+)、MDA-MB-435(ER-)的增殖的影響。
　　(2)采用體外劃痕愈合實(shí)驗(yàn)觀察三苯氧胺對乳腺癌細(xì)胞

2、遷移能力的影響，transwell小室侵襲試驗(yàn)觀察三苯氧胺對乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　(3)采用流式細(xì)胞術(shù)觀察三苯氧胺對乳腺癌細(xì)胞周期的影響，磷脂酰絲氨酸外翻法（AnnexinⅤ和PI雙染法）檢測三苯氧胺對乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響。采用JC-1檢測試劑盒檢測細(xì)胞線粒體跨膜電位。
　　(4)采用活性氧(ROS)檢測試劑盒、ATP含量檢測試劑盒等，檢測三苯氧胺對乳腺癌細(xì)胞中ROS和ATP能量代謝指標(biāo)變化的影響。
　　(5

3、)采用Western blot法檢測三苯氧胺對乳腺癌細(xì)胞中周期凋亡相關(guān)蛋白及BTG1蛋白表達(dá)的影響。
　　(6)細(xì)胞克隆形成法檢測三苯氧胺對乳腺癌細(xì)胞放射敏感性的影響。
　　(7)采用細(xì)胞流式術(shù)檢測三苯氧胺聯(lián)合電離輻射對乳腺癌細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。采用Western blot法檢測三苯氧胺聯(lián)合電離輻射對乳腺癌細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　(8)采用單細(xì)胞凝膠電泳和γ H2AX免疫熒光檢測三苯氧胺聯(lián)合電離輻射對乳

4、腺癌細(xì)胞照射后DNA損傷修復(fù)能力的影響。
　　(9)采用活性氧(ROS)檢測試劑盒檢測三苯氧胺聯(lián)合電離輻射對乳腺癌細(xì)胞中ROS的影響。
　　(10)構(gòu)建pcDNA-BTG1真核表達(dá)載體，應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到乳腺癌MCF-7細(xì)胞中，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BTG1MCF-7細(xì)胞株，采用RT-PCR和Western Blot法檢測細(xì)胞克隆中BTG1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，并對細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行鑒定。
　　(11)熒光定量PCR檢測三苯

5、氧胺聯(lián)合電離輻射對乳腺癌細(xì)胞中BTG1的mRNA表達(dá)水平影響。
　　(12) Western blot法檢測三苯氧胺聯(lián)合電離輻射對乳腺癌細(xì)胞BTG1蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)三苯氧胺可明顯抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-435細(xì)胞的生長，且呈現(xiàn)顯著的時(shí)間-劑量依賴關(guān)系。MDA-MB-435細(xì)胞24或48小時(shí)的IC50分別為:2.3μmol/L、1.7μmol/L，MCF-7細(xì)胞24小時(shí)的IC50為1.

6、2μmol/L。
　　(2)三苯氧胺作用后，乳腺癌MCF-7的侵襲能力同樣受到了明顯的抑制，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。但三苯氧胺不能明顯抑制MDA-MB-435細(xì)胞的體外侵襲能力。
　　(3)三苯氧胺可引起乳腺癌MCF-7細(xì)胞G2/M期阻滯。
　　(4)不同濃度三苯氧胺可誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞不同程度的凋亡，且與藥物濃度具有良好的相關(guān)性。三苯氧胺作用后乳腺癌MCF-7細(xì)胞線粒體膜電位下降，啟動(dòng)線粒體凋亡途徑。三苯氧胺可誘導(dǎo)

7、乳腺癌MCF-7細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)下降，caspase-3蛋白的表達(dá)隨著三苯氧胺濃度增加而降低。
　　(5)三苯氧胺可誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中ROS的爆發(fā)。ROS可抑制乳腺癌細(xì)胞生長作用，且這種抑制作用可被ROS清除劑所緩解。
　　(6)三苯氧胺可誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中BTG1表達(dá)隨著三苯氧胺濃度增加而增高。
　　(7)三苯氧胺對乳腺癌MCF-7細(xì)胞具有明顯的放射增敏作

8、用，增敏比為1.54。
　　(8)三苯氧胺聯(lián)合電離輻射，乳腺癌MCF-7細(xì)胞發(fā)生了顯著的G2/M期阻滯，說明三苯氧胺與電離輻射對細(xì)胞周期阻滯具有一定的協(xié)同作用。三苯氧胺作用于照射后的乳腺癌ER陽性細(xì)胞可通過抑制cyclinB1、cyclinD1和CDC2，從而誘導(dǎo)G2/M期阻滯，而提高其放射敏感性。
　　(9)三苯氧胺聯(lián)合電離輻射，促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡，提高其放射敏感性。
　　(10)加入三苯氧胺后，照射后乳腺

9、癌MCF-7細(xì)胞中的γ H2AX位點(diǎn)明顯增多，意味著三苯氧胺可加重照射后的乳腺癌ER陽性細(xì)胞DNA損傷程度，且DNA損傷后修復(fù)能力也明顯降低，從而提高其放射敏感性。
　　(11)三苯氧胺聯(lián)合電離輻射，促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞ROS釋放，提高其放射敏感性。
　　(12)三苯氧胺聯(lián)合電離輻射，調(diào)控乳腺癌MCF-7細(xì)胞BTG1表達(dá)，提高其放射敏感性。
　　結(jié)論：
　　(1)三苯氧胺可有效地抑制乳腺癌ER陽性細(xì)胞的生長、

10、轉(zhuǎn)移及侵襲。
　　(2)三苯氧胺可通過降低cyclin B1/cyclin D1的表達(dá)顯著誘導(dǎo)乳腺癌ER陽性細(xì)胞G2/M期阻滯。
　　(3)三苯氧胺可誘導(dǎo)乳腺癌ER陽性細(xì)胞內(nèi)ROS爆發(fā)，并通過OXPHOS引起線粒體途徑凋亡。
　　(4)三苯氧胺可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)ROS爆發(fā)，并通過OXPHOS引起線粒體途徑凋亡。
　　(5)三苯氧胺可增加乳腺癌ER陽性細(xì)胞的放射敏感性，其機(jī)制與細(xì)胞G2/M期阻滯相關(guān);與ROS增加，