miR-93在胃癌中的功能及機制研究.pdf

1、第一部分 miR-93在胃正常組織、胃癌組織及胃癌細胞株中的表達及其與胃癌臨床病理學(xué)學(xué)特征之間的關(guān)系
　　目的：檢測 mic roRN A-93（miR-93）在正常胃黏膜組織、胃癌組織及胃癌細胞株中的表達，分析其表達與胃癌臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性。
　　方法：收集20例正常胃黏膜標本，60對配對的胃癌及癌旁標本；購買6種胃癌細胞株（AGS、SGC-7901、MKN-28、MKN-45、HTB135及 MKN-74）及永生化的

2、胃黏膜上皮細胞株 GES-1。利用 qRT-PCR的方法檢測上述組織及細胞株中 miR-93的表達水平；利用 Mann-Whitney Test分析 miR-93的表達水平與胃癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：qRT-PCR檢測結(jié)果表明，與正常的胃黏膜組織及癌旁組織相比（相對表達量分別為0.462±0.031、0.864±0.056），miR-93在胃癌組織中的表達量顯著升高（2.093±0.156）；進一步分析表明其

3、表達水平與腫瘤的大小、pTNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)相關(guān)：miR-93在腫瘤直徑大于4.5c m中的表達量（1.576±0.013）顯著高于腫瘤直徑小于4.5cm中的表達量（1.309±0.036）；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達量（3.124±0.082）明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達量（1.871±0.054）；晚期胃癌（III、IV期）組織中 miR-93的表達量顯著高于其在正常胃黏膜組織及早期胃癌（I、II期）組織中的表達量，且其表

4、達水平隨胃癌的演進而升高。此外，我們在胃癌細胞株中也得到了與胃癌組織中一致的結(jié)果，即與正常的胃黏膜細胞株 GES-1比較（0.957±0.029），miR-93在胃癌細胞株AGS、SGC-7901、MKN-28、MKN-45、MKN-74、HTB135中的表達也顯著升高（分別為2.053±0.081、2.353±0.137、2.792±0.186、3.051±0.115、3.126±0.227、3.611±0.194）。
　　結(jié)論

5、：miR-93在胃癌組織和胃癌細胞中高表達，其表達的水平與胃癌的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及 pTNM分期有關(guān)，提示胃癌組織中高表達的miR-93可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。
　　第二部分 miR-93對胃癌細胞株生物學(xué)行為的影響
　　目的：在體外研究異常表達的miR-93對胃癌細胞增殖、周期、凋亡、侵襲及遷移能力的影響。
　　方法：使用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miR-93 mimics、miR-93 inhib itor轉(zhuǎn)入相應(yīng)的胃癌細

6、胞株 AGS與 HTB135中，引起 miR-93在上述細胞中的表達上調(diào)或下調(diào)，后分別采用CCK-8、流式細胞術(shù)及 Transwell實驗檢測異常表達的miR-93對胃癌細胞的增殖能力、周期分布、凋亡及侵襲與遷移能力的影響。
　　結(jié)果：CC K-8實驗的結(jié)果表明，與陰性對照組（miR-NC）相比，AGS細胞在轉(zhuǎn)染miR-93 mimics后48、72及96h的增殖能力明顯增強；相反，轉(zhuǎn)染 miR-93 inhibitor后48、7

7、2及96h，HTB135細胞的增殖能力受到顯著抑制。然而各轉(zhuǎn)染組細胞的增殖能力在轉(zhuǎn)染后24 h無明顯差異（P>0.05）。流式細胞術(shù)的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后48 h，與 miR-NC組比較，過表達 miR-93使 AGS細胞處于 G0G1期的比例顯著減少，而位于S期的細胞比例明顯增加；相反，當抑制miR-93的表達時，可使HTB135細胞周期阻滯于 G0G1期。然而，上述處理對 AGS及 HTB135的凋亡功能無明顯影響。Transwell實

8、驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后24 h，與 miR-NC組比較，轉(zhuǎn)染 miR-93 mimics的AGS細胞其侵襲及遷移能力顯著提高；相反，轉(zhuǎn)染miR-93 inhibitor的HTB135細胞其侵襲及遷移能力受到明顯抑制。
　　結(jié)論：體外功能學(xué)實驗表明 miR-93的表達可促進胃癌細胞的增殖，侵襲及遷移能力，提示miR-93在胃癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮促癌基因的功能。
　　第三部分 miR-93調(diào)控胃癌細胞生物學(xué)行為的機制探討
　

9、　目的：預(yù)測并驗證miR-93在胃癌細胞中的靶基因，進一步闡明 miR-93在胃癌中具體發(fā)揮促癌功能的分子學(xué)機制。
　　方法：使用在線生物學(xué)信息軟件 TargetScan與 MiRbase預(yù)測 miR-93的靶基因，通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀸Π谢蜻M行驗證。后使用Western blot和靶基因沉默實驗進一步明確miR-93通過對靶基因P21與P TEN的負調(diào)控而在胃癌細胞中發(fā)揮促癌功能。
　　結(jié)果：生物信息學(xué)軟件預(yù)測P2

10、1及PTEN是miR-93的靶基因；雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示 miR-93可顯著抑制野生型 pGL3-P21-WT及 pGL3-PTEN-WT的熒光素酶活性，而對其對突變體pGL3-P21-Mut及pGL3-PTEN-Mut的熒光素酶活性無顯著影響；Western blot結(jié)果進一步表明，miR-93可負調(diào)控 P21及 PTEN的表達；此外，靶基因沉默實驗結(jié)果顯示，抑制 P21及 PTEN的表達可促進胃癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力