miR-93靶向RAB11FIP1在宮頸癌發(fā)生中的作用及機制.pdf

1、宮頸癌(Cervical Cancer, CC)是全球女性最常見的婦科惡性腫瘤之一。隨著宮頸癌篩查的普及以及對于宮頸癌前病變的及時治療，使得宮頸癌的發(fā)生率在發(fā)達地區(qū)顯著下降，但在欠發(fā)達地區(qū)由于篩查未開展或不規(guī)范，宮頸癌的發(fā)生率仍然保持較高的水平。同時宮頸癌也是死亡率較高的女性惡性腫瘤，嚴重威脅廣大婦女的健康。業(yè)已公認，高危人乳頭瘤病毒（High Risk Human papillomavirus，HR-HPV）感染是宮頸癌發(fā)病的必需因素

2、，但不是惟一因素，除病毒感染以外，宿主因素也制約了疾病的發(fā)生和發(fā)展。研究這些因素在在宮頸癌發(fā)生與進展過程中的作用與機制，對制定宮頸癌防控新策略具有十分重要的意義。miRNA是一類非編碼小分子單鏈RNA，可以與靶基因mRNA3'非翻譯區(qū)結合，引起靶基因mRNA降解或翻譯抑制，在轉錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達。最近的研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs的表達異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切，但miRNA在不同的組織和細胞中發(fā)揮的生物學功能和機制并不相同，具有組織與

3、細胞特異性和時效性的特點。另外，同一個miRNA可以有多個不同的靶基因，多個不同的miRNA也可以同時作用于一個靶基因，從而造成不盡相同的生物學功能。因此，miRNA及其靶分子構成了一個巨大的錯綜復雜的生物調(diào)控網(wǎng)絡。已有研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的發(fā)揮了重要作用。迄今已發(fā)現(xiàn)多種miRNA在宮頸癌中表達下降，并通過各自不同的靶基因調(diào)控宮頸細胞的生物學行為，參與宮頸癌的發(fā)生、侵襲、轉移等過程。闡明miRNA在宮頸癌發(fā)生發(fā)展

4、過程中的作用及機制對探索宮頸癌防治新策略有重要意義。本課題組前期通過宮頸癌相關miRNA芯片篩查發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌組織表達改變的眾多miRNA中，miR-93表達升高。在此基礎上，本研究首先驗證miR-93在宮頸癌、高級別CIN和正常組織中的表達差異，并比較分析miR-93的表達水平與宮頸癌臨床不良預后因素的相關性。再通過基因功能實驗，探尋miR-93的異常表達對宮頸癌細胞生物學行為的可能作用并確定其發(fā)揮作用的靶基因。旨在為探尋宮頸癌發(fā)生與

5、進展新機制及宮頸癌防控新策略提供科學依據(jù)。本研究分為三個部分：
　　第一部分：宮頸癌及高級別CIN組織中miR-93表達及意義。
　　目的：驗證miR-93在宮頸癌及高級別CIN組織中表達上調(diào)，并探討miR-93表達與宮頸癌不良預后因素之間的相關性。
　　方法：收集宮頸鱗癌168例、CIN2-360例和正常上皮48例組織標本，采用Stem-loopRT-PCR和Real time PCR法檢測miR-93表達水平，并收

6、集宮頸癌患者的臨床病理資料，分析miR-93的表達水平與宮頸癌臨床不良預后因素的相關性。
　　結果：⑴miR-93在宮頸鱗癌和CIN2-3組織中的表達水平與宮頸正常上皮組織相比顯著上調(diào)，但兩者間無顯著差異。⑵miR-93表達與宮頸癌FIGO分期、盆腔淋巴結轉移、深間質(zhì)浸潤、陰道壁累及以及脈管浸潤無關。
　　結論：①宮頸癌組織中miR-93表達水平顯著高于宮頸正常組織，但與宮頸癌不良預后因素無顯著相關性。②高級別CIN組織中m

7、iR-93表達水平顯著高于宮頸正常組織，而高級別CIN組織與癌組織相比miR-93表達水平無差異，提示miR-93表達改變在宮頸癌發(fā)生發(fā)展進程中可能是一個早期事件。
　　第二部分：miR-93對宮頸癌細胞生物學行為的影響。
　　目的：明確miR-93對宮頸癌細胞增殖、凋亡、侵襲等生物學行為的調(diào)控作用。
　　方法：在宮頸癌細胞株Siha和CaSki中，利用細胞轉染技術抑制miR-93的表達，利用MTT法檢測細胞增殖能力，

8、流式細胞技術檢測細胞凋亡及細胞周期分布，Transwell侵襲試驗檢測細胞的侵襲能力。
　　結果：⑴在宮頸癌細胞中，下調(diào)miR-93表達抑制Siha和CaSki細胞的增殖，促進細胞的凋亡。⑵在宮頸癌細胞中，下調(diào)miR-93表達不改變細胞周期和侵襲力。
　　結論：miR-93表達下調(diào)抑制宮頸癌細胞增殖并促進凋亡，但對G1期細胞比例和細胞侵襲力沒有影響，與miR-93主要在宮頸癌發(fā)生階段發(fā)揮癌基因功能相符。
　　第三部分：

9、miR-93在宮頸癌細胞中靶向調(diào)控RAB11FIP1蛋白表達。
　　目的：確定miR-93的靶基因，以揭示miR-93促宮頸癌發(fā)生過程中的分子機制。
　　方法：通過軟件預測miR-93靶基因。用miR-93 inhibitor轉染宮頸癌細胞株Siha和CaSki，用Real time RT-PCR檢測RAB11FIP1 mRNA表達，用Westen Blot檢測RAB11FIP1蛋白表達。利用雙熒光素酶報告基因的方法確認mi

10、R-93與RAB11FIP1的靶向關系。同時在宮頸癌細胞株Siha和CaSki中，利用慢病毒轉染技術過表達RAB11FIP1蛋白，利用MTT法檢測細胞增殖能力，流式細胞技術檢測細胞的凋亡。用免疫組化的方法在宮頸組織中檢測RAB11FIP1蛋白表達。
　　結果：⑴抑制miR-93的表達上調(diào)宮頸癌細胞RAB11FIP1蛋白水平。⑵miR-93與含RAB11FIP13'UTR區(qū)的雙熒光素酶報告質(zhì)粒共轉染，下調(diào)熒光素酶的活性，而不影響3'

11、UTR區(qū)突變報告質(zhì)粒的熒光素酶活性。⑶在宮頸癌細胞中，上調(diào)RAB11FIP1蛋白的表達抑制Siha和CaSki細胞增殖，促進細胞的凋亡。⑷在宮頸癌及高級別CIN組織中，RAB11FIP1蛋白低表達，且miR-93表達與RAB11FIP1蛋白水平呈負相關，但與宮頸癌不良預后相關因素無關。
　　結論：①RAB11FIP1是miR-93的直接靶基因，miR-93通過靶向RAB11FIP1調(diào)控宮頸癌細胞的生物學功能。②上調(diào)RAB11FIP