cFLIP在宮頸癌發(fā)病機(jī)制中的意義及shRNA靶向逆轉(zhuǎn)研究.pdf

1、凋亡不僅與胚胎發(fā)育、機(jī)體內(nèi)環(huán)境動(dòng)態(tài)平衡及免疫應(yīng)答密切相關(guān)，也為腫瘤的研究開(kāi)辟了新方向。腫瘤不僅僅是細(xì)胞無(wú)控性生長(zhǎng)的結(jié)果，其與細(xì)胞凋亡異?；虻蛲鲎枰钟兄匾P(guān)系。細(xì)胞凋亡根據(jù)其起始轉(zhuǎn)導(dǎo)因子不同分為外源性凋亡途徑（死亡受體途徑）和內(nèi)源性凋亡途徑（線(xiàn)粒體途徑）。其中，外源性凋亡途徑的起始轉(zhuǎn)導(dǎo)因子為caspase-8（即FLICE，F(xiàn)ADD-like interleukin-1-beta converting enzyme）。cFLIP（cel

2、lularFLICE-like inhibitory protein）為caspase-8抑制蛋白，1997年由Irmler等在研究惡性黑色素瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)，其結(jié)構(gòu)類(lèi)似于caspase-8，但不具備酶活性。已有大量研究表明，cFLIP在多種人類(lèi)腫瘤組織中過(guò)表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要的調(diào)控作用。封閉cFLIP基因在胃癌、大腸癌、橫紋肌肉瘤等腫瘤組織中的表達(dá)，能夠有效提高細(xì)胞的凋亡率及其對(duì)化療藥物的敏感性。宮頸癌是嚴(yán)重危及女性健康甚至生命的三

3、大惡性腫瘤之一，近年發(fā)病率明顯增加，且趨向年輕化。盡管宮頸癌發(fā)生的確切分子機(jī)制尚不清楚，但研究表明其發(fā)生是多種致癌因素長(zhǎng)期協(xié)同作用的結(jié)果，如人乳頭瘤病毒（humanpapilloma virus，HPV）持續(xù)感染、基因變異和免疫逃避等。關(guān)于cFLIP在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有著何種作用，及其與HPV的相互關(guān)系，目前相關(guān)報(bào)道甚少。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的研究生物體基因表達(dá)、調(diào)控與功能的一項(xiàng)嶄新

4、技術(shù)，其本質(zhì)是由雙鏈RNA誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)同源基因的特異性轉(zhuǎn)錄后沉默現(xiàn)象，可高效、特異地沉默目的基因，成為目前腫瘤研究和治療的強(qiáng)有力手段之一。
　　 基于上述研究進(jìn)展，本課題進(jìn)行如下研究：
　　 目的：
　　 1.檢測(cè)宮頸病變組織中cFLIP與HPV-16E7的表達(dá)、相互關(guān)系及臨床意義。
　　 2. 應(yīng)用shRNA封閉cFLIP基因在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)，并解除對(duì)caspase-8的抑制作用。
　　 3

5、. 探索靶向cFLIP基因沉默，降低宮頸癌細(xì)胞增殖、提高細(xì)胞凋亡率及增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)放療、化療藥物敏感性的可能性。
　　 方法：
　　 1.免疫組織化學(xué)SP染色法檢測(cè)40例宮頸癌、40例宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervicalintraepithelial neoplasia，CIN)及20例正常宮頸組織中cFLIP與HPV-16 E7的表達(dá)情況。
　　 2. RT-PCR、Weston Blot分別檢測(cè)4株宮頸癌細(xì)胞Hela

6、、Siha、C33a 及Caski中cFLIPS、cFLIPL的mRNA與蛋白表達(dá)水平，并選擇Hela細(xì)胞作后續(xù)研究。
　　 3. 構(gòu)建靶向cFLIP的shRNA質(zhì)粒，脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，特異性封閉cFLIP基因表達(dá)，RT-PCR、Weston Blot檢測(cè)基因封閉效果。
　　 4. Weston Blot檢測(cè)下調(diào)cFLIP基因?qū)aspase-8蛋白表達(dá)的影響；MTT比色法、流式細(xì)胞技術(shù)分析cFLIP基因表

7、達(dá)下調(diào)對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響；激光共聚焦顯微鏡分析凋亡的形態(tài)學(xué)變化。
　　 5. Co60放療、化療藥物順鉑、伊立替康處理Hela細(xì)胞，MTT比色法、流式細(xì)胞技術(shù)分析下調(diào)cFLIP基因?qū)m頸癌細(xì)胞放、化療敏感性的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1. cFLIP及HPV-16E7在正常宮頸組織、CIN與宮頸癌組織中的表達(dá)均依次增強(qiáng)(P<0.05)。CIN Ⅰ組與CIN Ⅱ～Ⅲ組及宮頸癌組比較cFLIP表達(dá)有顯著性

8、差異（P<0.05），宮頸癌組與CIN Ⅱ～Ⅲ級(jí)組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）。cFLIP表達(dá)陽(yáng)性率與宮頸癌病理類(lèi)型、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期無(wú)關(guān)。CIN Ⅱ～Ⅲ組中HPV-16 E7(+)組cFLIP 陽(yáng)性表達(dá)率高于HPV-16E7(－)組的表達(dá)率(P<0.05)；宮頸癌、CIN Ⅰ組織中HPV-16E7(+)組和HPV-16 E7(－)組cFLIP陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　 2. 宮頸癌細(xì)胞株

9、Hela、Siha、C33a及Caski均存在cFLIPS、cFLIPL mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　 3. 靶向cFLIP的shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞株，可有效封閉cFLIPS、cFLIPL在mRNA與蛋白水平的表達(dá)；并影響caspase-8蛋白表達(dá)的水平。
　　 4. 下調(diào)cFLIP基因可阻抑Hela細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡(P<0.05)；能有效提高Hela細(xì)胞對(duì)放、化療的敏感性(P<0.05)。
　　 結(jié)論：