Notch信號通路在宮頸癌發(fā)病中的作用研究.pdf

1、目的：子宮頸癌是全球婦女發(fā)病率僅低于乳腺癌的第二個最常見的惡性腫瘤。宮頸癌的致病因素比較明確，人乳頭瘤病毒（humanpapillomavirus,HPV）感染已被確定是高危因素，尤以HPV16和18型最常見。HPVE6、E7癌基因整合到宿主細胞后，分別與p53和pRb結(jié)合，導(dǎo)致這兩種抑癌基因失活，改變了細胞生長周期的調(diào)控機制，引起宿主細胞永生化，最終引起宮頸癌。
　　研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路在維持細胞增殖、分化和凋亡之間的平

2、衡起著至關(guān)重要的作用，與人類惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。數(shù)十年前在宮頸癌的相關(guān)研究中檢測到Notch1，提示其在宮頸癌中可能發(fā)揮作用。從宮頸癌前病變發(fā)展到浸潤癌的過程中，Notch受體及其配體Jagged1蛋白水平升高。Notch1協(xié)同HPVE6和E7癌基因促進宮頸鱗狀上皮細胞惡變。但是也有研究表明Notch1在宮頸癌中具有抑癌作用，其雙重作用可能與Notch1濃度和宮頸病變不同階段有關(guān)。Notch信號激活對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epitheli

3、almesenchymaltransition,EMT）的啟動至關(guān)重要，EMT發(fā)生過程中上皮細胞經(jīng)過形態(tài)變化，轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞，降低細胞間的黏附能力和增加其運動能力，使細胞遷移能力增加，抑制細胞凋亡并加強侵襲能力，與腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。此外，Notch信號與其他信號，如Wnt/β-catenin、TGF-β、PI3K/Akt通路存在交互作用，通過不同機制對Notch信號通路進行調(diào)節(jié)。
　　本研究將了解Notch信號通路在

4、宮頸癌病變過程中可能發(fā)揮的作用，以及與HPV的相關(guān)性，旨在探討Notch信號通路與HPV感染在宮頸病變進展中潛在的作用機制，并欲求尋找能阻斷抑制宿主細胞分化的關(guān)鍵分子，為探索宮頸癌防治新策略和新靶點提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1、建立人宮頸癌裸鼠移植瘤模型。體外培養(yǎng)HPV16陽性的人宮頸癌細胞SiHa。擴增并提取小干擾RNA（miRNA）質(zhì)粒，包括HPV16E6-miRNA、HPV16E7-miRNA干擾質(zhì)粒和1個陰性對

5、照Neg-miRNA空白質(zhì)粒。將SiHa細胞接種到BALB/c裸鼠右前腋窩中部外側(cè)皮下，待腫瘤體積約為80~120mm3，根據(jù)成瘤情況32只裸鼠隨機分為4組，包括2個對照組，即生理鹽水組（簡稱鹽水對照組）和空質(zhì)粒組（Neg-miRNA組），2個治療組，即HPV16E6基因沉默組（HPV16E6-miRNA組）和HPV16E7基因沉默組（HPV16E7-miRNA組）。利用體內(nèi)轉(zhuǎn)染方式，定期定量對4組裸鼠分別行瘤內(nèi)多點注射生理鹽水、Neg

6、-miRNA、HPV16E6-miRNA、HPV16E7-miRNA，每隔2天注射一次，共注射9次，每次注射前測量腫瘤體積，腫瘤生長情況，最后一次給藥48小時后處死裸鼠，及時移植瘤取材，測量移植瘤體積徑和重量，分裝標本。
　　2、取材后提取RNA，采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測方法檢測SiHa細胞宮頸癌裸鼠移植瘤中目的基因的mRNA水平，包括Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κB。
　　3、收

7、集2014年3月至2015年12月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院因?qū)m頸病變行陰道鏡活檢或手術(shù)的宮頸組織，及時放入4％多聚甲醛固定，后放置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。其中宮頸病變包括低度宮頸上皮內(nèi)瘤變（LSIL）16例和高度宮頸上皮內(nèi)瘤變（HSIL）27例，術(shù)前未進行放化療的宮頸癌組織共21例，其中包括鱗狀細胞癌18例、腺癌3例，術(shù)前行新輔助化療的宮頸鱗癌5例、宮頸腺癌2例以及宮頸腺鱗癌1例，根據(jù)2009年FIGO分期包括IA期6例，IB期13例，IIA1

8、0例，同時期收集因子宮肌瘤或子宮腺肌癥行全子宮切除的宮頸標本共10例作為對照組。所有病例均采用羅氏Cobas4800HPV檢測系統(tǒng)，通過實時PCR對14種高危型HPVDNA進行擴增和檢測，包括HPV16、18和其余12種亞型（31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66及68）。對照組術(shù)前TCT檢查除外宮頸病變，HPV檢測結(jié)果為陰性，術(shù)后病理顯示宮頸無異常。收集所有手術(shù)病人的基本信息、HPV結(jié)果和完整的病理結(jié)果。所取

9、宮頸組織經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理會批準及患者和/或家屬知情同意。
　　4、人體宮頸組織標本采用免疫組織化學(xué)方法檢測目的基因的蛋白表達情況，包括Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κB。分析Notch信號通路對EMT和宮頸癌發(fā)病過程的影響。
　　結(jié)果：
　　1、成功建立裸鼠皮下移植瘤
　　1.1裸鼠全部存活，成瘤潛伏期約為30天，肉眼可見明顯移植瘤，體積約80~120mm3，外形不規(guī)則，個別

10、瘤體可出現(xiàn)潰破和出血，剝離瘤塊見瘤體質(zhì)硬，切面灰白色壞死灶，未見明顯血管生成，成瘤率為100%。1.2通過體內(nèi)轉(zhuǎn)染方式分別沉默HPV16E6和E7基因，兩個治療組裸鼠移植瘤在小鼠被處死前的體積和腫瘤重量均小于兩個對照組，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　1.3各組宮頸癌裸鼠移植瘤Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κB的mRNA水平
　　采用Real-TimePCR分別檢測4組移植瘤中目的基因的mR

11、NA的表達水平。HPV16E6基因沉默組和HPV16E7基因沉默組分別與空質(zhì)粒組和鹽水對照組比較，Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κBmRNA表達水平均降低，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義?？召|(zhì)粒組與鹽水對照組比較，Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κBmRNA的表達水平無差異，P>0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義。說明SiHa細胞宮頸癌移植瘤中的HPV16E6/E7基因沉默后，Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

12、途徑受抑制。
　　2、人體宮頸組織標本分析
　　2.1高危型HPV（high-oncogenicriskHPV,hr-HPV）感染率
　　hr-HPV感染檢出率隨著宮頸病變的進展升高。正常對照組無hr-HPV感染；LSIL組織中hr-HPV陽性率1.25%（2/16）；HSIL組織中hr-HPV陽性率88.89%（24/27）；宮頸癌組織中hr-HPV陽性率100%（29/29）。hr-HPV感染率以HPV16陽性為主

13、（45/55），其次為HPV18陽性（4/55）。2.2Notch信號通路Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κB蛋白的表達
　　在正常宮頸上皮和LSIL組織中，Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋白表達均較弱；而HSIL組中，上述5種目的蛋白表達為陽性；宮頸癌組織中，Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋白表達強陽性。Notch信號通路中Notch1、J

14、agged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋白的表達在宮頸病變進展過程中逐漸增多，LSIL上述5種目的基因的蛋白表達與宮頸癌比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　術(shù)前進行新輔助化療的宮頸鱗癌組織中上述蛋白表達較未行化療的宮頸鱗癌組織明顯減少，5種目的基因的蛋白表達比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而宮頸腺癌組織術(shù)前化療與未化療比較，上述蛋白表達無明顯變化，但因樣本例數(shù)小（2例），無法進行統(tǒng)計學(xué)分析。認為術(shù)前行新輔助化

15、療可以降低宮頸鱗癌組織Notch信號通路中Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋白的表達，而對宮頸腺癌組織中目的蛋白表可能無明顯影響。
　　結(jié)論：
　　1、成功建立了SiHa細胞宮頸鱗癌裸鼠皮下移植瘤模型，并利用RNA干擾技術(shù)證明HPV16E6-miRNA和HPV16E7-miRNA能夠有效抑制移植瘤生長，RNA干擾技術(shù)可用于宮頸癌的體內(nèi)研究；
　　2、沉默HPV16E6/E7基因抑制小鼠移植

16、瘤生長的效應(yīng)，可能通過下調(diào)Notch信號通路的主要基因Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB而發(fā)揮作用；
　　3、Notch信號通路中主要基因Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋白的表達隨宮頸病變進展而逐漸增多，Notch信號通路參與宮頸癌發(fā)生；
　　4、術(shù)前行新輔助化療可以降低宮頸鱗癌組織Notch信號通路中Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋