Toll樣受體9及其信號(hào)通路在甲狀腺相關(guān)眼病發(fā)病中的作用的研究.pdf

1、目的：
　　甲狀腺相關(guān)眼病(thyroid associated ophthalmopathy，TAO)是眼眶疾病中最常見的一種類型。目前的研究認(rèn)為其是一種自身免疫性疾病，與甲狀腺功能紊亂有關(guān)，常伴發(fā)于毒性彌漫性甲狀腺腫(Graves'disease，GD)。國外研究顯示，每百萬人群中Graves病發(fā)病率為210/年，男女比例為1∶3.9，高峰年齡為40-60歲，而TAO的發(fā)病率為42.2/百萬/年，約為Graves甲亢發(fā)病率的2

2、0.1％。目前TAO的確切發(fā)病機(jī)制仍不明確，缺乏針對(duì)性的治療措施，現(xiàn)有治療方案多以控制病情為主。同時(shí)由于TAO治療的前提是正確的臨床分期，而目前臨床普遍采用的CAS評(píng)分系統(tǒng)存在一定的主觀性，尤其對(duì)于非專門從事TAO診治的眼科和全科醫(yī)生，很難做到準(zhǔn)確分期。國外有研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體9(Toll-like receptor9，TLR9)激活可促進(jìn)漿細(xì)胞樣DC(pDC)分泌IFN-α，與SLE的疾病活動(dòng)性和預(yù)后密切相關(guān)。而前期研究發(fā)現(xiàn)活動(dòng)

3、期TAO患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR9表達(dá)明顯高于正常人群。因此推測(cè)TLR9是否同樣參與了TAO的發(fā)病過程，為了驗(yàn)證這一設(shè)想，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證活動(dòng)期TAO患者眼眶成纖維細(xì)胞(orbital fibroblasts，OFs)是否高表達(dá)TLR9，并與穩(wěn)定期TAO進(jìn)行對(duì)比，以期發(fā)現(xiàn)二者之間TLR9表達(dá)的差異。進(jìn)一步探究TLR9與OFs增殖、炎癥因子釋放之間的聯(lián)系，了解TLR9在TAO發(fā)病中的作用，為尋找TAO治療靶點(diǎn)提供依據(jù)和方向。
　　方

4、法：
　　本課題通過組織塊培養(yǎng)法，分別從活動(dòng)期TAO患者、穩(wěn)定期TAO患者及排除免疫性疾病為改善外觀而行眼眶減壓手術(shù)的正常人眼眶脂肪結(jié)締組織中分離純化OFs。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)方法分析各組TLR9mRNA表達(dá)水平的差異。用TLR9特異性配體——人工合成的含有CpG基序的寡脫氧核苷酸（CpG-ODN）刺激各組細(xì)胞，分別于刺激后0h、6h、12h、24h用qRT

5、-PCR方法檢測(cè)白介素-6(interleukins-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecular-1，ICAM-1)、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）mRNA表達(dá)水平的變化趨勢(shì)，并分別用不同濃度CpG ODN刺激各組OFs，作用不同時(shí)間，通過CCK8法測(cè)定各組細(xì)胞OD值的變化，計(jì)算細(xì)

6、胞活力，了解TLR9與OFs增殖之間的聯(lián)系。最后用特異性小干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)下調(diào)TLR9mRNA的表達(dá)水平，再次用qRT-PCR法檢測(cè)活動(dòng)期TAO組TLR9、IL-6、IFN-γ、ICAM-1mRNA表達(dá)水平，驗(yàn)證TLR9與炎癥因子IL-6、IFN-γ、ICAM-1合成和分泌之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1、經(jīng)組織塊培養(yǎng)法成功獲得各組OFs，經(jīng)形態(tài)學(xué)及免疫組化鑒定符合成纖維

7、細(xì)胞特征。
　　2、TLR9mRNA在活動(dòng)期TAO組OFs中表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，而在穩(wěn)定期TAO組中表達(dá)下調(diào)。
　　3、CpG-ODN刺激各組細(xì)胞后，活動(dòng)期TAO組OFs活力明顯升高，而穩(wěn)定期TAO組和正常對(duì)照組無明顯變化，這種作用在CpG-ODN作用48h后顯現(xiàn)，并且存在劑量依賴，在200nM時(shí)最明顯。
　　4、CpG-ODN刺激各組細(xì)胞后，活動(dòng)期TAO組OFs相關(guān)炎癥因子(IL-6、TNF-α、ICAM-1

8、、IFN-γ)mRNA的表達(dá)水平均不同程度升高，穩(wěn)定期TAO組OFs升高幅度不明顯，部分出現(xiàn)下調(diào)。
　　5、用siRNA下調(diào)活動(dòng)期TAO組OFs TLR9mRNA表達(dá)水平后，相關(guān)炎癥因子(IL-6、IFN-γ、ICAM-1)mRNA的表達(dá)水平亦呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，呈正相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1、組織塊培養(yǎng)法獲取OFs是可靠而有效的。
　　2、TAO活動(dòng)期患者來源的OFs高表達(dá)TLR9，而穩(wěn)定期患者來源的OFs相對(duì)低表達(dá)