IGF-1在甲狀腺相關眼病眼眶脂肪增殖中的作用及其相關信號轉導通路的研究.pdf

1、目的：
　　在甲狀腺相關眼病(thyroid-associatedophthalmopathy,TAO)患者眼眶脂肪基質(zhì)細胞(orbitaladipose-derivedstromalcell，OADSC)體外分離和培養(yǎng)的基礎上，研究胰島素樣生長因子1(insulin-likegrowthfactor1，IGF-1)對TAO患者OADSC增殖的影響，以及IGF-1在TAO患者OADSC向成熟脂肪細胞分化過程中的作用，并進一步探討其

2、相關信號傳導通路，為深入研究TAO患者眼眶脂肪組織異常增殖的影響因素以及TAO的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)，希望有助于為TAO的治療提供新的思路。
　　方法：
　　1.免疫組織化學方法檢測IGF-1蛋白在TAO患者和正常人眼眶脂肪組織中的表達。
　　2.膠原酶消化法分離TAO患者OADSC，并進行原代和傳代培養(yǎng);倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)特征;流式細胞儀檢測細胞表面標志物;成脂誘導培養(yǎng)液誘導OADSC細胞向成熟脂肪細胞分

3、化;采用油紅O對分化后的細胞進行染色。
　　3.CCK-8法檢測IGF-1對TAO患者OADSC細胞增殖的影響，包括:(1)10ng/mlIGF-1作用于OADSC，檢測第1天至第6天細胞生長曲線的變化;(2)不同濃度的IGF-1(0、1、10、20、100、200ng/ml)作用于OADSC，檢測72小時后細胞的增殖情況。
　　4.IGF-1作用于TAO患者OADSC細胞，成脂誘導分化后采用油紅O對細胞進行染色;倒置相差顯

4、微鏡下觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)含量的變化情況，并應用酶標儀對細胞內(nèi)的脂質(zhì)含量進行半定量測定。
　　5.IGF-1作用于TAO患者OADSC，成脂誘導分化10天后，real-timePCR檢測成脂標志基因脂聯(lián)素(adiponectin)、瘦素(leptin)、脂肪酸結合蛋白(adipocytefattyacidbindingprotein，AP2)及脂肪酸合成酶(fattyacidsynthase，F(xiàn)AS)mRNA水平的變化。
　　6.

5、Westernblot檢測IGF-1作用于TAO患者OADSC1小時后，細胞磷酸化Akt(phosphorylatedAkt，p-Akt)、總Akt蛋白水平的變化;檢測IGF-1作用于TAO患者OADSC，成脂誘導分化10天后，促進脂肪生成的重要轉錄因子—過氧化物酶增殖物活化受體(peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma，PPARγ)蛋白的表達情況。
　　結果：
　　1.免疫

6、組織化學檢測結果顯示:IGF-1蛋白在TAO患者組眼眶脂肪組織中的陽性表達率為26.33％;在正常人組眼眶脂肪組織中的陽性表達率為13.25％。
　　2.從TAO患者眼眶脂肪組織標本中成功地分離得到了OADSC細胞，并能在體外進行穩(wěn)定地原代和傳代培養(yǎng);倒置相差顯微鏡下觀察細胞呈長梭形;流式細胞儀檢測細胞表面標志物結果顯示:CD29(+)、CD44(+)、CD31(-)、CD45(-);成脂誘導培養(yǎng)液誘導分化10天后，細胞內(nèi)有脂質(zhì)堆

7、積并能被油紅O染為紅色。
　　3.IGF-1(10ng/ml)促進了TAO患者OADSC細胞生長(第2天至第6天，p＜0.05);不同濃度IGF-1作用于TAO患者OADSC細胞72小時后，與對照組相比，1ng/mlIGF-1沒有明顯地促進細胞增殖（p＞0.05），而10ng/ml、20ng/ml、100ng/ml、200ng/mlIGF-1均促進了細胞增殖(p＜0.01），并且100ng/mlIGF-1對OADSC生長的促進作用

8、最明顯(p＜0.05）。
　　4.三組TAOOADSC細胞成脂誘導分化10天后，油紅O染色，酶標儀測定細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積情況。結果顯示:IGF-1組細胞內(nèi)脂質(zhì)含量最多，不含IGF-1組細胞內(nèi)脂質(zhì)含量最少（較IGF-1組約減少50％），IGF-1+αIR3組細胞內(nèi)脂質(zhì)含量居中（較IGF-1組約減少40-45％）。
　　5.IGF-1作用于TAO患者OADSC細胞成脂誘導分化10天后，real-timePCR檢測成脂標志基因mRNA

9、的表達:脂聯(lián)素、瘦素、脂肪酸結合蛋白、脂肪酸合成酶mRNA分別為對照組的6.8±1.4倍、7.3±0.7倍、2.7±0.7倍和4.0±0.6倍;IGF-1對TAO患者OADSC細胞的這一促進效應能被αIR3（IGF-1受體的阻斷性抗體）或LY294002（PI3K信號傳導通路特異性抑制劑）顯著抑制。
　　6.IGF-1(10ng/ml)作用于TAOOADSC細胞1小時后，磷酸化Akt(phosphorylatedAkt，p-Akt

10、)蛋白的表達顯著上調(diào)，但總Akt蛋白的表達無明顯變化;IGF-1(10ng/ml)作用于TAOOADSC細胞成脂誘導分化10天后，PPARγ蛋白的表達水平較對照組增高;上述兩種效應能均能被αIR3或LY294002所抑制。
　　結論：
　　1.IGF-1蛋白在TAO患者組眼眶脂肪組織中的表達水平較正常人組高。
　　2.應用膠原酶消化法可以分離得到原代TAO患者OADSC細胞，并且能在體外進行穩(wěn)定地傳代培養(yǎng)和擴增，建立供

11、進一步研究的體外細胞模型。
　　3.通過細胞表面標志物分析提示，TAO患者OADSC細胞是一組間充質(zhì)來源的細胞;該細胞在成脂誘導培養(yǎng)液的作用下可向成熟脂肪細胞分化。
　　4.IGF-1能顯著地促進TAO患者OADSC細胞增殖和成脂誘導分化，并增加成脂誘導分化后細胞內(nèi)的脂質(zhì)堆積。
　　5.IGF-1經(jīng)由IGF-1受體(IGF-1R)和PI3K細胞信號傳導通路上調(diào)PPARγ蛋白的表達，進而促進TAO患者OADSC向成熟脂肪