硒誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS在MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、硒是一種具有重要生物功能的必需微量元素，在生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。硒在環(huán)境中的分布存在有明顯的地域差異，一般熱帶以及亞熱帶含硒較高，而溫帶以及森林或草原地帶含硒較低。國(guó)外有研究表明，一些腫瘤如胃癌、食道癌、直腸癌等的發(fā)病率和硒的地理分布呈負(fù)相關(guān)，低硒地區(qū)腫瘤的發(fā)病率和死亡率比較高。國(guó)內(nèi)也有研究通過(guò)分析不同肝癌高發(fā)區(qū)的糧食硒的水平后，發(fā)現(xiàn)硒的分布有明顯的地區(qū)差異，并且與肝癌的流行負(fù)相關(guān)。一些流行病學(xué)調(diào)查和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明高濃度的硒具有化學(xué)

2、防癌作用。
　　 硒的抗腫瘤作用的機(jī)制有不少報(bào)道，但是總的來(lái)說(shuō)，其防癌、抗癌作用機(jī)理目前還不是十分清楚。認(rèn)為可能主要有以下幾個(gè)方面：1.抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。各種形式的硒均可以抑制CDC2+和PKC(蛋白激酶C)的活性，從而抑制細(xì)胞增殖；硒可以和還原性谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)產(chǎn)生活性氧(ROS)，啟動(dòng)一些凋亡信號(hào)途徑而促使腫瘤細(xì)胞凋亡。2.降低一些誘癌因子的誘變性。硒可以降低某些能激活致癌原的羥化酶如芳基羥化酶的活性

3、；硒還可以和一些致癌性的金屬離子相互作用，從而拮抗它們的活性。3.調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)人體免疫系統(tǒng)的抗癌能力。4.調(diào)節(jié)一些生物體內(nèi)抗氧化酶如谷胱甘肽過(guò)氧化酶的活性，防止脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)生物膜不受損傷，防止突變。
　　 另一方面，硒的生理需要量范圍比較窄，有人認(rèn)為硒的攝入量超過(guò)生理需要量10倍就可能達(dá)到中毒閾劑量水平，30～50 倍可導(dǎo)致中毒。目前有關(guān)硒化合物的毒性作用機(jī)制也不是十分清楚，主要認(rèn)為可能有以下兩個(gè)方面：1.硒化合物

4、的毒性和其催化產(chǎn)生的 ROS 有關(guān)。硒在較高濃度下產(chǎn)生ROS，它們可以和一些生物大分子包括蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，從而使其受損。2.硒可使體內(nèi)的一些代謝酶如琥珀酸脫氫酶等失活，從而使機(jī)體受損。
　　 總而言之，無(wú)論是硒的抗腫瘤作用還是硒的毒性作用可能都和ROS 有關(guān)。ROS和一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也密切相關(guān)，無(wú)論是內(nèi)源性還是外源性的ROS 都可以調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的活性。不同的信號(hào)途徑通過(guò)MAPKs 調(diào)節(jié)細(xì)胞生

5、理過(guò)程的很多方面，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡。
　　 本研究用硒處理HepG2 細(xì)胞以及給Wistar大鼠灌胃后，利用彗星實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、Western-blot 等方法觀察細(xì)胞的DNA 損傷和凋亡情況以及ROS和MAPK的表達(dá)水平，探討硒染毒產(chǎn)生ROS在MAPKs 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的調(diào)節(jié)作用。本研究共分兩部分。
　　 第一部分硒誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制的研究
　　 首先為了了解不同濃度硒對(duì)細(xì)胞活性的影響

6、，本研究應(yīng)用MTT 試驗(yàn)檢測(cè)了不同劑量(0、2.5、5、10、20 μmol/L)處理HepG2 (12、24、48 h)不同時(shí)間后的細(xì)胞活性。結(jié)果表明隨著濃度以及作用時(shí)間的增加，亞硒酸鈉對(duì)HepG2的抑制增殖作用越明顯。10μmol/L 亞硒酸鈉作用12 h和5 μmol/L 亞硒酸鈉作用24 h 后細(xì)胞活性與對(duì)照組比較明顯降低，差異有顯著性(P<0.05)。10、20 μmol/L的亞硒酸鈉處理細(xì)胞后，在三個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)(12、24、

7、48 h)都可見(jiàn)細(xì)胞活性明顯降低。
　　 為了了解硒處理細(xì)胞后ROS的變化情況，本研究用流式細(xì)胞儀測(cè)定不同濃度硒(0、2.5、5、10、20 μmol/L)處理細(xì)胞不同時(shí)間(0.5、1、2 h)后細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。ROS的測(cè)定是采用DCFH-DA，它本身不發(fā)熒光，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后水解生成非熒光的DCFH，在ROS的存在下氧化成發(fā)熒光的DCF。
　　 結(jié)果顯示5、10、20 μmol/L 亞硒酸鈉作用于HepG2 lh，隨著

8、濃度增加，產(chǎn)生的ROS 也增加。與對(duì)照組相比，當(dāng)亞硒酸鈉濃度≥5μmol/L 時(shí)，流式峰明顯右移，平均熒光強(qiáng)度增加(P<0.05)。10 μmol/L 亞硒酸鈉處理HepG2 細(xì)胞0.5 h 后，即可以見(jiàn)到到熒光強(qiáng)度明顯增加 (P<0.05)。為了闡明不同濃度硒處理細(xì)胞后其DNA 損傷以及凋亡情況，我們通過(guò)彗星試驗(yàn)(單細(xì)胞瓊脂糖凝膠電泳)、流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞損傷以及凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0、2.5、5、10、20 μmol/L 亞硒酸鈉作

9、用HepG2 24小時(shí)后，當(dāng)亞硒酸鈉濃度≥5μmol/L時(shí)，Olive 尾矩明顯增加，DNA 損傷加重，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明0、2.5、5、10、20 μmol/L 亞硒酸鈉處理HepG2 24 h 后，5、10、20 μmol/L組早期凋亡細(xì)胞以及晚期凋亡細(xì)胞/壞死細(xì)胞均比對(duì)照組高((P<0.05)。
　　 隨亞硒酸鈉劑量從0 μmol/L 增加到20 μmol/L，早期凋亡率和晚期

10、凋亡/壞死細(xì)胞率分別從1.11[％]、2.60[％]增加到16.6[％]、10.15[％]。10 μmol/L 亞硒酸鈉處理HepG2 0、12、24、48 h 后，早期凋亡和晚期凋亡/壞死細(xì)胞分別從1.11[％]、2.60[％]增加到23.52[％]、14.8[％]。
　　 為了了解MAPKs在亞硒酸鈉導(dǎo)致細(xì)胞凋亡中的可能作用，我們用不同濃度(0、2.5、5、10、20 μmol/L)亞硒酸鈉處理HepG2 細(xì)胞 4 h 后，

11、使用Western-blot 技術(shù)檢測(cè)c-Jun 氨基末端激酶(JNK)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)以及p38的表達(dá)水平。結(jié)果表明各處理組p38、磷酸化p38、ERK1/2和磷酸化ERK1/2 水平和對(duì)照組無(wú)明顯差異，而磷酸化JNK1/2的水平隨著亞硒酸鈉的劑量的增加而增加。10 μmol/L 亞硒酸鈉處理HepG2細(xì)胞 0、1、2、4、8 h 后，用Western-blot 技術(shù)檢測(cè)磷酸化的JNK1/2 水平。結(jié)果1 h 后磷酸化的

12、JNK1和JNK2分別為對(duì)照的1.58和1.80 倍；4 h 后磷酸化的JNK1和JNK2分別為對(duì)照的2.48和5.03 倍；8 h 后，和亞硒酸鈉處理4 h 相比，磷酸化的JNK1/2 水平下降。
　　 最后為了進(jìn)一步闡明ROS 以及JNK1/2在細(xì)胞凋亡中的可能作用以及ROS 對(duì)JNK1/2的影響，我們使用ROS 清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)后來(lái)看亞硒酸鈉處理細(xì)胞對(duì)細(xì)胞活性、DNA 損傷程度、凋亡情況以及JNK1/2 表

13、達(dá)水平的影響，以及使用JNK1/2抑制劑sp600125 后來(lái)看凋亡情況以及JNK1/2 表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明NAC 增加了細(xì)胞活性并降低了細(xì)胞凋亡率以及DNA 損傷程度，并且NAC處理的亞硒酸鈉組ROS水平下降，Western-blot 結(jié)果表明NAC 抑制了JNK1的磷酸化。和10 μmol/L 亞硒酸鈉單獨(dú)作用組比較，Sp600125 預(yù)處理的10 μmol/L 亞硒酸鈉組磷酸化的JNI1/2 水平降低(P<0.05)，并且與

14、對(duì)照組比較，細(xì)胞早期凋亡率也下降(P<0.05)。
　　 第二部分硒亞急性染毒對(duì)wistar大鼠的影響
　　 為了闡明硒的毒作用表現(xiàn)及氧化應(yīng)激在其中所起的作用，我們將36 只雄性wistar大鼠隨機(jī)分成6組，各組劑量分別為0、0.125、0.25、0.5、1、2mg/kg體重，經(jīng)口灌胃7周，每天同一時(shí)間灌胃一次．每周記錄一次大鼠體重以及飼料消耗量，染毒結(jié)束后斷頭取血檢測(cè)臨床生化指標(biāo)，取肝、腎等組織稱重、做病理切變并用彗星

15、實(shí)驗(yàn)分析其DNA 損傷情況．
　　 結(jié)果表明，染毒七周后，和對(duì)照組相比，0.125mg/kg組大鼠的平均體重增加，但是經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；2mg/kg 亞硒酸鈉組，7周后體重降低(P<0.05)。臟器系數(shù)分析結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，1mg/kg和2mg/k 亞硒酸鈉組，肝臟的相對(duì)重量增加(P<0.05)；2mg/kg 亞硒酸鈉組，腎臟和脾臟的相對(duì)重量增加(P<0.01)。對(duì)心臟和睪丸則未見(jiàn)影響，各組之間未見(jiàn)差異(P>0.05)。

16、
　　 我們通過(guò)彗星實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究亞硒酸鈉對(duì)大鼠肝、腎的DNA 損傷情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示和對(duì)照組相比較，0.5、1、2mg/kg 亞硒酸鈉組肝、腎細(xì)胞OTM 值增加，表明DNA損傷增加(P<0.05)。
　　 綜上所述，本研究結(jié)果表明：
　　 (1)亞硒酸鈉可抑制HepG2 細(xì)胞活性，且具有劑量和時(shí)間依賴性，NAC 可以拮抗亞硒酸鈉對(duì)細(xì)胞活性的抑制作用。
　　 (2)亞硒酸鈉可使HepG2 細(xì)胞內(nèi)的ROS

17、增加，而NAC 可以使亞硒酸鈉誘導(dǎo)的ROS 下降.
　　 (3)亞硒酸鈉可導(dǎo)致HepG2 細(xì)胞DNA 受損，細(xì)胞凋亡增加，NAC 可以使亞硒酸鈉導(dǎo)致的細(xì)胞DNA 受損程度降低，并減少細(xì)胞凋亡。
　　 (4)亞硒酸鈉可激活JNK1/2，NAC和sp600125 可使JNK1/2 磷酸化激活受到抑制，并且sp600125 降低了亞硒酸鈉導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。
　　 (5)2 mg 亞硒酸鈉/kg體重亞急性染毒主要導(dǎo)致大鼠肝