JNK信號轉導通路在去甲斑蝥素誘導肝癌細胞凋亡中的作用.pdf

1、肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上常見的惡性腫瘤之一，目前在肝癌的治療中還存在早期診斷困難，根治性切除機會小，復發(fā)轉移率高，對放化療不敏感，總體療效欠佳的現(xiàn)狀。去甲斑蝥素（norcantharidin NCTD）是斑蝥素的化學結構中去除1，2位甲基人工合成而得的衍生物。臨床上主要用于食管癌、膽管癌及乳腺癌等的治療，尤其在肝癌中的治療效果較好。有實驗研究認為NCTD可以通過誘導肝癌細胞的凋亡起到

2、抗腫瘤的作用，但其引起凋亡的具體機制尤其是哪些信號轉導通路參與其中尚有待進一步闡明。其中c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-teminal Kinase，JNK)信號轉導通路與核轉錄因子-kappaB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號轉導通路在調控細胞凋亡的機制中研究較多。我們通過體外細胞實驗研究，探討NCTD對肝癌細胞增殖和凋亡影響及JNK與NF-κB信號轉導通路在其中發(fā)揮的作用。
　　 目的:本實

3、驗主要通過不同濃度的NCTD干預體外培養(yǎng)的人肝肝癌細胞SMMC-7721，研究其對活化的肝癌細胞增殖及凋亡的影響;以及JNK與NF-κB信號轉導通路在其中可能的作用機制。
　　 方法:應用MTT法檢測NCTD對活化的肝癌細胞增殖的影響;Hoechst33342染色熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)學變化;流式檢測細胞凋亡率;以Western blot法檢測JNK、p-JNK、NF-κBp65及IκBα蛋白表達。
　　 結果:<

4、br>　　 1、去甲斑蝥素對SMMC-7721增殖的影響
　　 MTT法檢測細胞增殖顯示，對照組與不含DMSO組A492值無差別(p＞0.05)，說明0.05％DMSO對SMMC-7721增殖沒有影響;不同濃度的去甲斑蝥素(5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml)分別作用12h、24h、36h、48h與各時間對照組相比A492值明顯降低，對照組的A492值總體均數(shù)與不同濃度的去甲斑蝥素組的

5、差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);不同時間與濃度的去甲斑蝥素的作用對肝癌細胞的抑制率具有一定的時間和劑量依賴性。48h時抑制最強且IC50約為40μg/ml。
　　 2、去甲斑蝥素對SMMC-7721凋亡的影響
　　 2.1、Hoechest33342染色熒光顯微鏡下檢測細胞凋亡形態(tài)顯示:對照組細胞大小均勻，NCTD干預SMMC-7721后，細胞核濃縮、凋亡小體出現(xiàn)，說明NCTD可誘導活化的肝癌細胞凋亡，除無DMSO組與

6、對照組間凋亡率無統(tǒng)計學差異(p＞0.05);其他各組在加入40μg/mlNCTD作用不同時間(12h，24h，36h，48h)后細胞凋亡率與對照組相比有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。說明DMSO對肝星狀細胞凋亡無明顯影響，去甲斑蝥素對肝癌細胞有促進凋亡的作用，且與藥物作用時間有關，作用時間越長凋亡率越高，12h開始增高(11.2％±0.20％)，48h明顯增多(34.13％±1.00％)。
　　 2.2、流式細胞儀檢測細胞凋亡率結

7、果示:DMSO組與對照組間凋亡率無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)，其他各組作用48h后細胞凋亡率與對照組相比有統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。去甲斑蝥素對肝癌細胞有促進凋亡的作用，且與藥物濃度有關，濃度越高作用越強。在加入NCTD前1h預先加入JNK特異性阻斷劑SP600125后，細胞凋亡率（19.60％±0.70％）較40μg/mlNCTD組（25.63％±1.12％）有所下降(p＜0.05)。表明SP600125可一定程度抑制去甲斑蝥素的促

8、凋亡作用。
　　 3、去甲斑蝥素及SP600125對SMMC-7721細胞中JNK與NF-κB信號通路的影響
　　 3.1、DMSO對細胞各通路影響結果分析:Western blot結果顯示，無DMSO組與對照組間各蛋白表達灰度值無明顯差異(p＞0.05)，說明DMSO對SMMC-7721細胞的JNK與NF-κB兩條信號轉導通路無明顯影響。
　　 3.2、NCTD及SP600125對JNK信號通路影響:對JNK信

9、號通路蛋白灰度值分析顯示，除DMSO組外，其他各組與對照組間p-JNK的表達有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)，且隨藥物濃度升高p-JNK的表達逐漸增強，當在藥物組預先加入SP600125后，p-JNK的表達較40μg/mlNCTD組明顯下降。而JNK的表達在各組間無明顯變化。說明，NCTD在對SMMC-7721的作用中使JNK的活化增加，而SP600125可有效抑制NCTD對其的活化。
　　 3.3、NCTD及SP600125對NF

10、-κB信號通路影響:對NF-κB信號通路蛋白灰度值分析顯示，除DMSO組外，其他各組與對照組間核蛋白NF-κBp65及胞漿IκBα蛋白的表達有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)，且隨藥物濃度升高NF-κBp65及IκBα的表達都逐漸降低，當藥物組預先加入SP600125后，NF-κBp65及IκBα的表達較40μg/mlNCTD組有所增加，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。NCTD在對SMMC-7721的作用中使NF-κB的活化降低，而SP60

11、0125在有效抑制JNK活化的同時，對NF-κB也起到了一定促進活化的作用。
　　 結論:
　　 1、體外細胞培養(yǎng)研究結果表明，去甲斑蝥素可抑制活化SMMC-7721細胞的增殖，其抑制作用具有一定時間-劑量效應。
　　 2、去甲斑蝥素可誘導SMMC-7721細胞凋亡，且其在促進細胞凋亡中具有一定的時間與劑量依賴性。
　　 3、去甲斑蝥素通過促進JNK信號轉導通路的活化與抑制NF-κB活性促進SMMC-77