斑蝥素和去甲斑蝥素抗膀胱腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、斑蝥是鞘翅目(Coleoptera)芫青科(Meloidae)斑芫青屬(Mylabris)昆蟲的俗稱，是有效抗腫瘤天然藥物。斑蝥素(Cantharidin，CA)是斑蝥抗腫瘤的有效成份，其是一種半帖烯毒素，可從蟲體提取或人工合成。因其口服及靜脈注射具有強(qiáng)烈的泌尿系統(tǒng)和消化系統(tǒng)刺激作用，不易為患者所接受而限制了它的使用。去甲斑蝥素(Norcantharidin，NCTD)是CA的衍生物，與CA有類似的抗腫瘤作用，且其毒性明顯低于CA。盡管

2、祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在臨床實(shí)踐中早已將斑蝥提取物用于某些腫瘤的治療中，但將其提取物及其衍生物作為腔內(nèi)灌注預(yù)防與治療淺表膀胱腫瘤國內(nèi)外均未見報(bào)告。 目的：研究CA和NCTD對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞體外的生長抑制作用及其作用機(jī)理，進(jìn)一步研究CA和NCTD膀胱灌注治療小鼠膀胱腫瘤的作用及其機(jī)制，為斑蝥提取物及其衍生物膀胱灌注治療人膀胱腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 內(nèi)容CA和NCTD抗膀胱腫瘤細(xì)胞系的體外實(shí)驗(yàn)研究，CA和NCTD膀胱灌注對(duì)小鼠膀胱和血液影響

3、的安全性研究，CA和NCTD膀胱灌注治療小鼠膀胱腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究。 方法：使用不同濃度的CA和NCTD對(duì)人膀胱腫瘤EJ、T24、SqCa細(xì)胞和小鼠膀胱腫瘤細(xì)胞MB49進(jìn)行體外培養(yǎng)，取藥物作用不同時(shí)間的細(xì)胞進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)和FCMAnnexinV-PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，進(jìn)而選擇出一種抑制膀胱腫瘤細(xì)胞增殖的有效藥物，并篩選出最佳藥物濃度和作用時(shí)間。用最佳濃度的藥物與細(xì)胞共同培養(yǎng)，光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡、丫啶橙熒光染色、Hoechs

4、t33258熒光染色法觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，激光共聚焦顯微鏡觀察(FITC-AnnexinV/PI雙染色法)MB49細(xì)胞凋亡，凝膠電泳觀察凋亡細(xì)胞的DNA片斷化；分光光度法檢測(cè)細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性變化；Westernblot法檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)的變化；PCR-TRAP-銀染法檢測(cè)端粒酶活性變化，激光共聚焦顯微鏡測(cè)定MB49細(xì)胞胞漿內(nèi)Ca2+濃度變化。5倍最佳抑制細(xì)胞增殖濃度的CA

5、和NCTD進(jìn)行小鼠膀胱灌注，常規(guī)病理和電鏡檢測(cè)小鼠膀胱和FCM檢查血液淋巴細(xì)胞亞群變化。復(fù)制小鼠膀胱原位腫瘤種植模型后將篩選出最佳濃度的藥物對(duì)小鼠膀胱進(jìn)行灌注，觀察記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠生存時(shí)間、腫瘤生長情況、小鼠生存情況(包括體重、活動(dòng)、飲食、血尿的出現(xiàn)等)，免疫組化驗(yàn)證CA和NCTD對(duì)小鼠膀胱腫瘤的抑制作用。 結(jié)果：CA和NCTD在體外對(duì)人膀胱腫瘤EJ、T24細(xì)胞和小鼠膀胱腫瘤MB49細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，在一定的濃度和時(shí)

6、間范圍內(nèi)呈明顯的時(shí)間一效應(yīng)關(guān)系和濃度-效應(yīng)關(guān)系，抑制EJ和T24細(xì)胞的最佳藥物濃度CA為20gmol/L、NCTD為60μmol/L；抑制MB49細(xì)胞的最佳藥物濃度CA為40μmol/L、NCTD為60μmol/L；NCTD對(duì)于SqCa細(xì)胞增殖的抑制作用不明顯，而CA對(duì)于SqCa細(xì)胞增殖的抑制作用明顯，最佳藥物濃度為60μmol/L；用最佳藥物濃度的CA和NCTD與膀胱腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，隨著作用時(shí)間延長Caspase分光光度法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)C

7、asoase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性增加；Westernblot顯示，T24和MB49細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)均逐漸減弱，Bax的表達(dá)均逐漸增強(qiáng)。PCR-TRAP-銀染法檢測(cè)顯示，MB49細(xì)胞的端粒酶活性隨著CA作用時(shí)間的延長而逐漸減弱；激光共聚焦顯微鏡測(cè)定MB49細(xì)胞胞漿內(nèi)Ca2+濃度明顯增加。C57BL/6小鼠原位膀胱腫瘤模型的成瘤率為96.7％。CA組治愈率為80％，NCTD為60％，均明顯高于對(duì)照組的13.

8、3％。TUNEL檢測(cè)顯示，用藥組殘存腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，越近腫瘤表面，凋亡越明顯。灌注后，血液淋巴細(xì)胞亞群各組無差別，用藥組的膀胱移行上皮明顯變薄外，無其它異常改變。各組的肝、脾、肺、心、腎未見明顯損害。 結(jié)論：CA和NCTD體外對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞有良好的抑制作用，其作用機(jī)理可能與其激活Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性，增強(qiáng)bcl-2和減弱Bax的表達(dá)，增加胞漿中Ca2+濃度而誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。硝酸銀灼傷、