Cdc6參與腫瘤細胞干性及去甲斑蝥素誘導腫瘤干細胞凋亡.pdf

1、腫瘤干細胞(Cancer stem cell，CSC)是指腫瘤組織中的一群具有無限自我更新能力的細胞，是促使腫瘤無限生長的來源。CSC能夠抵抗放化療的殺傷，是腫瘤復發(fā)的蓄庫和轉(zhuǎn)移的根源。如何有效抑制或清除CSC成為了當今腫瘤領(lǐng)域的研究熱點，而誘導并維持CSC多潛能“干性”的分子機制是CSC研究的核心問題。
　　Cdc6(cell division cycle6)主要功能為起始DNA復制，在腫瘤細胞中高表達且與腫瘤惡性進程相關(guān)，而C

2、dc6的高表達不僅僅是腫瘤旺盛增殖所導致的結(jié)果，Cdc6本身就有促進細胞惡性轉(zhuǎn)化的能力。最近研究發(fā)現(xiàn)，Cdc6在腫瘤細胞中可作為轉(zhuǎn)錄抑制因子抑制抑癌基因INK4/ARF的轉(zhuǎn)錄，INK4/ARF能同時編碼3個蛋白:p16INK4A、p15INK4B和p14ARF，分別通過pRb和p53通路調(diào)控細胞周期。INK4/ARF在人類腫瘤中出現(xiàn)頻發(fā)的失活，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關(guān)。而且此基因轉(zhuǎn)錄抑制是CSC多潛能“干性”的重要特征，因此Cd

3、c6極有可能通過抑制INK4/ARF參與CSC多潛能“干性”。
　　去甲斑蝥素(Norcantharidin)是我國自主研發(fā)的抗腫瘤藥物，目前被廣泛應用于多種腫瘤的治療，但其具體的抗腫瘤機制目前仍未完全闡明，本課題組之前研究發(fā)現(xiàn)NCTD能降解腫瘤細胞Cdc6蛋白，發(fā)揮抗腫瘤活性。
　　目的:
　　1、通過有限稀釋法從建系腫瘤細胞株中篩選獲得CSC，并鑒定。
　　2、探究在CSC中，Cdc6蛋白表達情況及其是否參與

4、調(diào)控INK4/ARF基因。
　　3、探究去甲斑蝥素（抑制Cdc6）對CSC的影響。
　　方法:
　　1、CSC篩選:取建系的腫瘤細胞HepG2和UMUC-3，超低吸附培養(yǎng)板中進行單克隆培養(yǎng)，加入無血清培養(yǎng)基（含EGF20ng/mL、b-FGF20ng/mL、LIF20ng/mL、干細胞添加劑B2720μL/mL和BSA4μg/mL的DMEM/F12培養(yǎng)基），連續(xù)培養(yǎng)2個月以上獲得。
　　2、CSC鑒定:利用qPC

5、R、流式細胞術(shù)，檢測腫瘤干細胞標志物CD133、CD44、NANOG、OCT4、ABCG2;裸鼠體內(nèi)成瘤實驗檢測細胞成瘤能力。
　　3、CSC功能學方面檢測:MTS實驗檢測體外細胞增殖及化療藥物的殺傷、EdU摻入實驗檢測DNA復制、流式細胞術(shù)檢測細胞周期。
　　4、通過Western blotting和Chromatin binding檢測Cdc6蛋白總量及染色質(zhì)中和非染色質(zhì)部分的表達。
　　5、通過Chromatin

6、 Immunoprecipitation(ChIP)檢測Cdc6與INK4/ARF基因調(diào)控區(qū)域的相互作用。
　　6、通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。
　　結(jié)果:
　　1、HepG2和UMUC-3經(jīng)有限稀釋法培養(yǎng)5天可見成球生長的單克隆細胞團，培養(yǎng)20天后取單克隆細胞團繼續(xù)擴大培養(yǎng)至60天。
　　2、CSC鑒定:流式細胞結(jié)果顯示，篩選60天的HepG2細胞CD133+比例高達90.4±1.1％，顯著高于母代腫瘤細胞

7、（0.5±0.2％），CD44+比例為0.5±0.12％也高于母代腫瘤細胞（0.1±0.04％）。qPCR結(jié)果顯示CD133、CD44、NANOG、OCT4、ABCG2的mRNA含量均顯著高于母代腫瘤細胞。體內(nèi)成瘤實驗顯示，接種篩選后的HepG2細胞（1×105個/只）成瘤率為1/5，5×106個/只的成瘤率為3/5，而相對應的母代HepG2均未成瘤。這些結(jié)果表明通過本方法篩選出的細胞即為CSC。
　　3、CSC對紫杉醇耐藥(PT

8、X)。MTS結(jié)果顯示:PTX對HepG2-CSC和UMUC-3-CSC的IC50均＞＞500nM/ml，遠大于其對母代HepG2（60.9±5.7）、UMUC-3(63.0±4.8)。
　　4、CSC為靜止休眠期細胞。流式細胞細胞周期檢測顯示CSC的G0/G1期比例顯著提高（HepG2-CSC:70.72±5.2％，UMUC-3-CSC:70.24±4.9）;EdU摻入實驗顯示CSC幾乎無DNA復制，表明CSC大多處于靜止期。血清

9、釋放后靜止的CSC重新進入增殖周期，且血清釋放四天后，CSC的增殖速率顯著高于母代腫瘤細胞。
　　4、靜止休眠期CSC中Cdc6的表達。Chromatin binding顯示，靜止期CSC的Cdc6仍有相當數(shù)量的表達，且大多結(jié)合于染色質(zhì)上，與相對應的母代腫瘤細胞相比，非染色質(zhì)部分的含量顯著降低。血清釋放進入增殖周期后，非染色質(zhì)結(jié)合的Cdc6逐漸增多，至24小時后恢復到與母代腫瘤細胞相似的水平。
　　5、通過ChIP顯示，在C

10、SC中，Cdc6結(jié)合在INK4/ARF基因調(diào)控區(qū)（RDINK4/ARF）(-311～-157)區(qū)域，而在-175～-51區(qū)域沒有結(jié)合。
　　6、CSC加入NCTD培養(yǎng)后，HepG2-CSC和UMUC-3-CSC凋亡比例（70.54±0.26％，29.93±1.32％）顯著高于對照組（35.00±0.89％，15.11±0.78％）。
　　結(jié)論:
　　1、通過有限稀釋法能有效地從建系腫瘤細胞株中篩選獲得處于靜止休眠期的C