去甲斑蝥素對四氯化碳誘導急性肝損傷大鼠的保護作用及活化肝星狀細胞凋亡的影響.pdf

1、肝損傷是多種肝臟疾病共有的一種病理變化結果,其長期存在是導致肝纖維化,甚至肝硬化、肝癌發(fā)生的重要始動因素。四氯化碳誘導肝損傷模型是經典的肝損傷模型,其機制是氧化應激在肝損傷中起著主導作用,造成肝細胞變性、壞死及炎癥反應。在肝損傷和損傷修復過程中,靜止型肝星狀細胞激活轉變?yōu)榧〕衫w維細胞(MYB),具有產生大量ECM的特征,并且當損傷刺激不能及時去除,多數(shù)向肝纖維化發(fā)展。因此,去除病因、減輕肝損傷、針對過量活化}tSC靶向治療等成為綜合防治

2、肝損傷的主要措施。去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)作為斑蝥素的衍生物不僅保留了抗腫瘤活性和提升白細胞的作用,并且明顯降低了毒副作用。已有報道NCTD可以保護肝功能,但是保肝機制均未詳細報道。并且還具有抗乙肝病毒作用。研究顯示NCTD能夠誘導腫瘤細胞凋亡,推測NCTD對活化HSC具有誘導凋亡作用。為此,本研究來研究去甲斑蝥素對四氯化碳肝損傷的保護保護作用及抗氧化應激機制,同時探討其對大鼠活化HSC是否具有促凋亡作用,從

3、而為去甲斑蝥素臨床應用提供實驗依據(jù)。
　　 目的:本課題旨在研究觀察NCTD對四氯化碳誘導的大鼠急性肝損傷保護作用及活化肝星狀細胞凋亡的影響。
　　 方法:
　　 ①實驗大鼠被隨機分為正常對照組、肝損傷模型組(模型組)、雙環(huán)醇對照組(陽性對照組)和去甲斑蝥素兩個劑量的治療組(10mg/kg,20mg/kg)。模型組、陽性對照組和治療組分別用四氯化碳造成大鼠急性實驗性肝損傷,去甲斑蝥素組加用去甲斑蝥素片分兩個劑量(

4、10mg/kg/d,20mg/kg/d)于造模型當天即開始灌胃2周。陽性對照組用雙環(huán)醇120mg/kg/d灌胃,正常對照組和肝損傷模型組灌胃以相同劑量的蒸餾水2周。各組均于2周末留取標本。經組織石蠟切片}玎巳及Masson染色檢測模型建立及治療后的病理改變情況;利用病理圖像分析軟件來檢測肝組織Masson染色膠原面積密度:測定血清ALT、AST酶含量;測定肝組織SOD活性含量和MDA含量;免疫組化方法檢測肝組織中α-SMA的表達變化;T

5、UNEL和α-SMA免疫組織化學雙標染色方法檢測HSC的凋亡。
　　 ②NCTD干預體外培養(yǎng)的大鼠肝星狀細胞,研究其對肝星狀細胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)、Casepase3活性的變化及對活化的肝星狀細胞凋亡的影響。
　　 結果:
　　 ①四氯化碳誘導的急性肝損傷模型組與正常組比較,模型組血清ALT、AST。酶含量升高,且模型組大鼠肝臟明顯腫脹,外觀呈

6、暗黃或土黃色。通過肝組織石蠟切片臟和Masson三色染色病理顯示肝脂肪變性明顯,炎細胞浸潤和纖維組織增生等。結果證明四氯化碳誘導的大鼠肝損傷模型建立成功。雙環(huán)醇組和NCTD組治療后上述病理改變均減輕。
　　 ②NCTD對大鼠肝功能的影響:模型組血清ALT和AST’含量比正常對照組升高了559.78％和212.29％均有顯著差別(P＜0.01);雙環(huán)醇組和NCTD治療組(20 mg/kg)與模型組比較,均使ALT降低了35.19％

7、和27.19％,AST降低了42.45％和39.18％,統(tǒng)計均有意義(P＜0.05);雙環(huán)醇組和NCTD(20mg/kg)治療組沒有明顯差異(P＞0.05)。
　　 ③通過對膠原面積密度半定量分析,結果顯示模型組比正常對照組膠原含量明顯升高了317.3％(P＜0.01);雙環(huán)醇組和NCTD治療組均使得膠原含量降低,統(tǒng)計結果有意義(P＜0.05),但治療的三組間沒有統(tǒng)計差異(P＞0.05)。
　　 ④NCTD對大鼠肝組織氧

8、化應激的影響:與正常組相比,模型組肝組織中SOD含量降低了75.5％和MDA含量升高405.64％,統(tǒng)計有明顯差別(P＜0.01);治療后,雙環(huán)醇對照組和治療組與模型組比較肝組織中SOD含量升高和MDA含量降低均有差別(P＜0.05);雙環(huán)醇和NCTD(20 mg/kg)治療效果相同,但二者沒有統(tǒng)計差異(P＞0.05)。
　　 ⑤用免疫組織化學檢測α-SMA在損傷大鼠肝臟的表達變化,結果模型組肝組織α-SMA的陽性表達細胞明顯高

9、于正常對照組648.8％有顯著差別(P＜0.01),NCTD(10mg/kg、20mg/kg)治療組較模型組下降17.6％和39.25％,差別有統(tǒng)計意義(P＜0.05),呈劑量依賴關系。
　　 ⑥TUNEL和α-SMA免疫組織化學雙標染色方法檢測HSC的凋亡表明,治療組在凋亡數(shù)和凋亡率均高于模型組(P＜0.05),特別是高劑量(20 mg/kg)NCTD組表現(xiàn)明顯。
　　 ⑦JC-1試劑盒流式細胞儀法檢測細胞的早期凋亡線

10、粒體膜電位改變結果示:5.0μg/ml去甲斑蝥素組分別作用于HSCs6h、12h、24h與陰性對照組相比線粒體膜電位均降低(0.891±0.057、0.591±0.010、0.714±0.016)較陰性對照組(1.872±0.019)相比,均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　 ⑧Caspase3活性檢測顯示:5.0μg/ml的去甲斑蝥素作用活化的肝星狀細胞6h、12h、24h、36h后,Caspase3活性(0.657±0.0