四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷中自噬的作用及其機(jī)理研究.pdf

1、肝臟是機(jī)體的重要器官，承擔(dān)著物質(zhì)代謝、氨基酸利用、膽汁酸合成與轉(zhuǎn)化、生物合成與轉(zhuǎn)化、氧化保護(hù)、解毒等生理功能。許多理、化、生等因素均可損傷肝臟，導(dǎo)致一系列肝臟疾病的發(fā)生，如肝衰竭、肝纖維化、肝硬化等。研究發(fā)現(xiàn)，自噬是真核細(xì)胞中存在的溶酶體依賴性降解途徑，在清除錯誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)，損壞的細(xì)胞器例如過氧化物酶、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，以及消除細(xì)胞內(nèi)病原體等方面發(fā)揮了重要作用。研究表明，自噬在肝臟損傷的過程中起著重要的作用，肝臟的許多功能依賴自噬

2、的發(fā)生反應(yīng)。然而，對四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘導(dǎo)的急性肝損傷中自噬的作用及調(diào)控機(jī)制尚不明確。
　　因此本實驗以SD大鼠作為研究模型，將它們分為CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷組與正常對照組。首先，為了觀察CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷中自噬的動態(tài)變化，實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qR

3、T-PCR)和蛋白免疫印跡反應(yīng)(Western blot)檢測肝損傷過程中自噬相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，免疫熒光方法檢測LC3蛋白熒光聚點(diǎn)的積聚現(xiàn)象，之后用MDC染色法觀察晚期自噬溶酶體的分布，HE染色觀察大鼠急性肝損傷過程中肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，油紅O染色檢測脂肪滴生成情況。實驗結(jié)果表明，與對照組相比較，LC3B在CCl4肝損傷后3-6h的基因表達(dá)上調(diào)，隨后開始逐漸下調(diào);Atg5基因和蛋白的表達(dá)變化趨勢和LC3B相一致;SQSTM1/p62的

4、表達(dá)在急性肝損傷中3-6 h表達(dá)量降低，之后逐漸升高。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，正常肝組織的LC3B蛋白呈彌散狀態(tài)分布，CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷3h后，細(xì)胞核周圍有LC3熒光聚集;MDC染色結(jié)果指出，正常組肝臟中，MDC熒光表達(dá)量較弱，CCl4肝損傷6 h MDC熒光聚點(diǎn)逐步的增加，熒光信號此時最強(qiáng)，之后逐漸減弱。綜上可知，自噬在CCl4急性肝損傷早期有明顯的上調(diào)，而且在一定的范圍內(nèi)具有明顯的時間-效應(yīng)關(guān)系。為了進(jìn)一步研究自噬在CCl4誘導(dǎo)的急

5、性肝損傷過程中的作用，實驗采用腹腔注射自噬特異性抑制劑羥氯喹(CQ)進(jìn)行預(yù)處理后，再聯(lián)合CCl4誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷，通過免疫熒光方法來檢測自噬流的變化;HE染色觀察CQ聯(lián)合CCl4處理后肝組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)和油紅O染色檢測脂肪滴生成情況;同時取下腔靜脈血進(jìn)行ALT和AST血清酶活性檢測。免疫熒光結(jié)果表明，CQ處理組肝臟組織中有少量的LC3蛋白斑點(diǎn)積聚，CQ聯(lián)合CCl4處理6h后，LC3蛋白的熒光聚點(diǎn)現(xiàn)象顯著。CQ處理組與對照組相比，HE染色

6、結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)沒有顯著性的變化，但CQ聯(lián)合CCl4組，隨著處理時間增加，肝索逐漸消失，肝小葉結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂;油紅O染色結(jié)果表明，CQ聯(lián)合CCl4處理組，脂肪滴顯著性增多，細(xì)胞核碎裂。酶活性檢測結(jié)果表明，CCl4肝損傷后ALT和AST酶活性呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，CQ聯(lián)合CCl4處理組酶活性增加程度更加明顯。最后，免疫熒光進(jìn)一步檢測p21蛋白在肝損傷中的表達(dá)變化。自噬受到抑制以后，p21蛋白表達(dá)程度增加，說明自噬可以通過抑制p21蛋