梔子大黃湯對四氯化碳致小鼠急性肝損傷保護作用的研究.pdf

1、肝臟是人體內(nèi)重要的實質(zhì)性器官之一，是消化系統(tǒng)重要的組成部分。肝臟的功能極其復雜，參與食物的消化是肝臟作為消化腺的基本功能，肝臟分泌的膽汁是一種重要的消化液。除此之外，它還參與了糖類、脂類、蛋白質(zhì)和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)的合成、轉(zhuǎn)化、儲備與分解等，此外，激素、代謝產(chǎn)物、藥物等物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和解毒也是在肝臟內(nèi)進行的，肝臟是代謝最活躍的器官，肝臟還具有一定的免疫功能，在胚胎時期承擔著機體的造血功能。由此可見，肝臟在人體發(fā)揮的重要作用是很多其他器官無法比

2、擬的，各種病因?qū)е碌母闻K結(jié)構(gòu)或功能上的損傷，勢必會影響人的健康，甚至危及生命。常見的影響肝臟正常功能的因素有酗酒、感染病原體（病毒、寄生蟲等）、自身免疫、高脂飲食、過度勞累等。就發(fā)達國家而言，肝病及肝臟相關(guān)的主要死因是酒精性肝病。我國是肝病的高發(fā)國，肝病以病毒性肝炎為主，其中乙型病毒性肝炎病又占絕大多數(shù)。2006年流行病學調(diào)查顯示，我國乙肝表面抗原攜帶率在1～59歲一般人群中為7.18％，據(jù)此可以推算，我國有慢性乙肝感染者約有9300萬

3、人，其中約2000萬人為慢性乙型肝炎患者。預防醫(yī)學固然在降低乙肝感染率上發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，但是對于已經(jīng)慢性感染乙肝病毒的患者，尤其是慢性乙型肝炎的患者，如何進行乙肝的治療仍然是醫(yī)學界的一個難題?，F(xiàn)代醫(yī)學在乙肝的治療方面積極探索，研制出了許多藥物，包括保肝降酶的藥物和抗病毒藥物?？共《舅幬锇ǜ蓴_素和核苷類抗病毒藥物，這些藥物在臨床上廣泛應用，取得了一定的效果，但是由于藥物的副反應、病毒耐藥、治療費用和周期、有效率等因素也影響了其應用

4、，開發(fā)更加有效、經(jīng)濟、安全的藥物來治療病毒性肝炎仍然在探索之中。
　　病毒感染、酒精攝入、藥物、化學毒物和自身免疫等因素均可以導致肝損傷，不同病因引起的肝損傷機制不盡相同，某種病因所導致的肝損傷機制也是由很多方面組成，涉及多個環(huán)節(jié)，不同機制之間又存在相互聯(lián)系和影響，因此，肝損傷的機制十分復雜，目前尚未完全研究清楚。已知的肝損傷途徑涉及改變質(zhì)膜完整性、線粒體功能失調(diào)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、氧化應激、肝細胞鈣超載、免疫紊亂，炎癥細胞因子釋放、補

5、體及免疫變態(tài)反應、細胞凋亡等。
　　肝損傷是現(xiàn)代醫(yī)學術(shù)語，中國醫(yī)學中并無“肝損傷”的直接記載，根據(jù)肝損傷患者的癥狀、體征等臨床表現(xiàn)，我們可以查到諸多類似的記載和論述。中醫(yī)學中的“脅痛”、“黃疸”、“癥瘕積聚”、“鼓脹”等病癥均與肝損傷有關(guān)。在治療方面，審證求因、辨證論治和辨病施治相結(jié)合、局部與整體相結(jié)合是中醫(yī)治病處方的基本原則。僅就病毒性肝炎來說，中醫(yī)學認為病毒性肝炎的病因可分為內(nèi)外兩方面，內(nèi)因是正氣不足，外因是“濕熱疫毒”侵犯機

6、體，病位并不局限于肝，還涉及脾胃膽腎等臟腑。脾胃運化失司，肝膽疏泄失常，氣滯、濕阻、熱郁、血瘀，因而出現(xiàn)脅痛、黃疸、鼓脹、積聚等臨床表現(xiàn)。因此在治療上并不因為是“肝炎”而僅僅局限于治肝，濕熱證在肝病中較為多見，清熱利濕是肝病中常用的治法，但健脾疏肝、化瘀活血也均占有相當大的比重，久病及腎，肝腎同源，肝病過程中出現(xiàn)腎臟的病證則會從腎治療。中醫(yī)藥治療肝損傷或肝系病癥，無論是從實驗研究來看還是在臨床實踐中，凡應用得法，皆可取得不錯的效果。

7、r>　　梔子大黃湯出自漢代著名醫(yī)家張仲景所著的《傷寒雜病論》一書，原文記載“酒黃疸，心中懊憹，或熱痛，梔子大黃湯主之”，梔子大黃湯:梔子十四枚、大黃一兩、積實五枚、豉一升。梔子大黃湯具有瀉熱除煩之功，書中記載用它治療酒疸，熱重于濕者，酒疸為濕熱蘊于中焦，上蒸于心，故心中懊憹;濕熱阻滯，氣機不利，不通則痛，故心中熱痛。治用梔子大黃湯清心除煩，方中梔子、豆豉清熱除煩，大黃、枳實除積瀉熱。后代醫(yī)家將其用于治療熱重濕輕之肝膽疾患，如急性黃疸型肝

8、炎，也用于無黃疸型肝炎。有研究顯示梔子大黃湯對酒精性肝損傷有保護作用，其機制可能與減輕酒精導致的過氧化有關(guān)。對于其他類型的肝損傷的治療并未見文獻報道，其治療肝損傷的機制并未見進一步的研究。
　　目的:
　　本研究擬建立四氯化碳急性肝損傷模型，研究研究梔子大黃湯對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的保護作用，并初步探究其保護作用的作用機制。通過血清ALT、AST改變以及肝組織病理評估肝損傷模型的建立與治療效果，通過檢測肝組織MDA和S

9、OD水平和檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達探究其保護作用與抗氧化應激和抗凋亡之間的關(guān)系。為梔子大黃湯的臨床應用提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.梔子大黃湯的制備梔子大黃湯按梔子10g，大黃5g，枳實12g，淡豆豉10g的組成，經(jīng)水煎提取2次合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成低濃度(含生藥量0.3g/ml)、中濃度(含生藥量0.6g/ml)、高濃度（含生藥量1.2g/ml）的藥液。
　　2.動物分組和造模方法72只昆明小鼠隨機分成6組

10、，每組12只，分別為:正常對照組、模型組、聯(lián)苯雙酯(200mg/kg)組、梔子大黃湯低（6g/kg）、中（12g/kg）、高(24g/kg)劑量組。各給藥組每天按照相應濃度的藥物灌胃一次，灌胃體積為20ml/kg，正常組和模型組每天灌胃等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃5天。除正常組外，各組最后一次灌胃一小時后，腹腔注射0.12％的CCl4溶液，劑量為10ml/kg，正常組注射等體積的花生油，禁食，自由飲水。注射CCl4溶液16小時后，腹腔注射

11、1％戊巴比妥鈉50mg/kg麻醉小鼠，摘取眼球采血，全血室溫放置1小時后，經(jīng)離心機3000r/min離心10min后取上清備用。采血后處死小鼠，取肝部分左葉置于4％多聚甲醛溶液中固定，剩余肝左葉放入凍存管中于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?br>　　3.檢測指標和檢測方法
　　3.1血清AST、ALT含量測定嚴格按照試劑盒說明書步驟進行。
　　3.2肝組織病理學檢測多聚甲醛固定后的肝組織經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片后，經(jīng)HE染色，觀察

12、肝組織病理學改變。
　　3.3肝組織MDA、SOD含量測定取一部分肝臟用生理鹽水制成10％肝勻漿，按試劑盒說明書操作，檢測肝組織中SOD的活力、MDA的含量。
　　結(jié)果:
　　梔子大黃湯對CCl4誘導急性肝損傷小鼠的ALT、AST影響
　　與正常對照組相比較，模型組小鼠血清ALT、AST水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明CCl4誘導急性肝損傷的模型建立成功;陽性對照藥聯(lián)苯雙酯顯著降低ALT水平

13、(P＜0.05)，梔子大黃湯各組均能降低ALT水平(P＜0.05)，中、高劑量組能降低AST水平(P＜0.05)，梔子大黃湯三個劑量之間AST、ALT差異有顯著性(P＜0.05)，高劑量組效果最好。與聯(lián)苯雙酯組比較，梔子大黃湯高劑量組ALT差異無顯著性(P＞0.05)，AST差異有顯著性(P＜0.05)，提示梔子大黃湯高劑量組降低ALT水平與聯(lián)苯雙酯無統(tǒng)計學差異，降低AST水平優(yōu)于聯(lián)苯雙酯。梔子大黃湯具有保肝作用，能對抗CCl4導致小鼠

14、急性肝損傷引起的血清ALT、AST水平升高。
　　梔子大黃湯對CCl4所致急性肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響
　　肝組織切片經(jīng)HE染色后光鏡下觀察，正常對照組小鼠肝組織清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞呈放射狀排列，匯管區(qū)清楚。模型組小鼠肝小葉中央靜脈周圍明顯灶狀壞死，肝細胞空泡樣變，排列不規(guī)整，可見小灶狀炎細胞浸潤。與模型組相比，陽性對照組和給藥組肝組織壞死區(qū)域減小，細胞腫脹、變性等病理性損傷均有不同程度減輕，以梔子大黃湯高劑量

15、損傷程度最低。
　　梔子大黃湯對CCl4所致急性肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD的影響
　　與正常對照組相比較，模型組的小鼠肝組織的MDA含量顯著升高(P＜0.05)，肝臟SOD活性顯著降低(P＜0.05);與模型組相比較，陽性對照藥聯(lián)苯雙酯和3個給藥組均能顯著地降低肝組織MDA含量以及升高SOD活性(P＜0.05)。梔子大黃湯三個劑量MDA、SOD差異有顯著性(P＜0.05)，高劑量組效果最好。與聯(lián)苯雙酯比較，梔子高劑量組M

16、DA、SOD差異均無顯著性(P＞0.05)，表明梔子大黃湯高劑量與聯(lián)苯雙酯效果無差異。表明梔子大黃湯具有抗氧化的作用，能對抗CCl4引起的小鼠肝組織MDA增加和SOD活性降低。
　　梔子大黃湯對CCl4所致急性肝損傷小鼠肝臟中Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3表達的影響
　　與正常對照組相比，模型組Bax和Cleaved caspase-3表達水平增加(P＜0.05)，Bcl-2表達水平減少(P＜0.05

17、)，說明CCl4引發(fā)了小鼠肝細胞凋亡。與模型組相比，陽性藥和梔子大黃湯不同程度下調(diào)Bax和Cleaved caspase-3表達(P＜0.05)，上調(diào)Bcl-2表達(P＜0.05)。梔子大黃湯中劑量和高劑量組下調(diào)Cleaved caspase-3強于聯(lián)苯雙酯(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)采用0.12％的CCl4腹腔注射KM小鼠可以成功復制出急性肝損傷模型。在注射16小時采血和取肝組織能夠能夠觀察到明顯的血清ALT