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文檔簡介
1、目的:
川楝素是從我國傳統(tǒng)中藥楝科植物川楝子和苦楝皮中提取出的一種四環(huán)三萜類化合物,具有廣泛的藥理作用。近幾年來研究證明,川楝素在體外可明顯抑制多種腫瘤細胞的增殖,但其機制僅有初步探討。本論文通過體外細胞培養(yǎng),體內建立荷瘤小鼠模型,全面系統(tǒng)地研究川楝素對實體腫瘤肝癌的抗腫瘤作用,并進一步探討川楝素的作用機制及毒副作用。同時,考慮到在治療方法上血液系統(tǒng)惡性腫瘤有別與實體癌,因此,以人慢性髓系白血病K562細胞為研究對象,從增
2、殖抑制、分化、凋亡三方面對川楝素藥理作用及其機制進行初步探討。
方法:
1.以人肝癌SMMC-7721(P53+)、Hep3B(P53-)細胞為實驗對象,從以下幾個方面研究川楝素在體外對人肝癌細胞生長的抑制作用及機制:細胞計數(shù)法和MTT法檢測川楝素對SMMC-7721、Hep3B細胞和正常肝細胞IAR-20、LO2生長曲線的影響并計算增殖抑制率;觀察SMMC-7721、Hep3B細胞形態(tài)學改變;Annexin
3、V法檢測早期凋亡率;比色法檢測Caspase-3、8、9相對活性改變;免疫細胞化學法檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和Fas的表達變化。
2.建立H22荷瘤小鼠模型,從以下幾個方面觀察川楝素在體內對小鼠腫瘤生長的抑制作用及機制:量取腫瘤體積,觀察腫瘤的生長曲線;剝瘤后稱重計算小鼠的腫瘤抑制率;腫瘤組織行病理形態(tài)學及HE染色觀察;透射電鏡觀察超微結構改變;觀察川楝素對荷瘤小鼠心、肝、脾、腎、胸腺、睪丸組織的影響;免疫組化方
4、法檢測腫瘤組織內Bcl-2、Bax和Fas蛋白的表達。
3.以人慢性髓系白血病細胞K562(P53-)為研究對象,從以下幾個方面研究川楝素在體外對K562細胞增殖、分化、凋亡作用的影響及其機制:MTT法檢測川楝素對K562細胞和正常人外周血單個核細胞(PBMCs)增殖的影響;觀察K562細胞形態(tài)學變化和超微結構的改變;AnnexinV法檢測早期凋亡率;DNA ladder分析;聯(lián)苯胺和POX染色法觀察紅系和粒系分化情況;比
5、色法檢測Caspase-3、8、9相對活性改變;免疫細胞化學法檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和Fas的表達。
結果:
1.肝癌細胞系體外實驗中,0.5μmol/L川楝素可明顯抑制肝癌SMMC-7721、Hep3B細胞增殖,且抑制作用呈時間和劑量依賴性,而對正常肝細胞IAR-20、LO2增殖影響較??;川楝素處理后SMMC-7721、Hep3B細胞黏附力降低,部分細胞皺縮變圓;流式細胞術檢測到0.5μmol/
6、L川楝素作用SMMC-7721、Hep3B細胞72h的凋亡率分別為21.55%、13.35%,經(jīng)caspase抑制劑z-VAD-fmk處理后,細胞凋亡率降低,TSN+z-VAD-fmk組與TSN組比較有顯著性差異(P<0.05);川楝素處理SMMC-7721細胞后,Caspase-3、8、9活性均增高,Bcl-2表達減弱,Bax和Fas表達較對照組增強;川楝素處理Hep3B細胞,Caspase-3、Caspase-9活性增高,Caspa
7、se-8活性無明顯變化,Bcl-2表達減弱,Bax表達增強,而Fas表達無明顯變化。
2.動物實驗顯示,川楝素可顯著抑制小鼠體內腫瘤的生長,川楝素低劑量組(0.173mg/kg)、高劑量組(0.69mg/kg)的抑瘤率分別為66.23%、87.01%(P<0.05);腫瘤組織超微結構透射電鏡觀察可見凋亡小體;HE染色顯示小鼠心、肝、脾、腎、睪丸臟器形態(tài)正常,而胸腺組織可見胸腺小葉的數(shù)量及面積減少甚至消失;免疫組化證實,小鼠
8、腫瘤組織內Bcl-2蛋白表達下調,Bax、Fas蛋白表達上調(P<0.05)。
3.人慢性髓系白血病細胞體外實驗中,川楝素對K562細胞有明顯增殖抑制作用,呈時間和濃度依賴性,而對PBMC幾乎無影響;普通光鏡可見K562細胞典型的凋亡形態(tài)學改變;超微結構顯示凋亡細胞和凋亡小體;10,30,50 nmol/L川楝素處理K562細胞72 h后的早期凋亡率分別為9.66%,26.06%,52.70%(P<0.01);瓊脂糖凝膠電
9、泳可見典型“梯狀”條帶;聯(lián)苯胺和POX染色結果陰性;激活K562細胞Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9活性;凋亡相關蛋白Bcl-xl表達降低,Bax,F(xiàn)as表達增強(P<0.05)。
結論:
1.體內體外實驗均表明:川楝素對肝癌細胞有較強的抑制增殖和誘導凋亡作用,涉及線粒體途徑的參與。
2.體外實驗表明:川楝素對人慢性髓系白血病K562細胞具有抑制增殖,誘導凋亡的藥理效應
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