蛇床子素誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡與分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:白血病是血液系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，發(fā)病原因復(fù)雜，分型多，治療困難，預(yù)后差，常規(guī)化療效果差，而且毒副作用大，患者常常因并發(fā)感染或出血導(dǎo)致早期死亡。因此白血病的治療更需要一種緩解率高，毒副作用小的有效藥物。蛇床子素是我國的傳統(tǒng)中藥蛇床子的提取物。具有解痙、抗炎等多種藥理作用。并且近些年發(fā)現(xiàn)蛇床子素還具有通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的抗腫瘤作用，已在多種實(shí)體瘤細(xì)胞株中得到證實(shí)，并對其凋亡機(jī)制做了部分研究，但針對血液系統(tǒng)腫瘤的研究較少，只有少數(shù)實(shí)

2、驗(yàn)證明蛇床子素對HL-60細(xì)胞有抑制增殖作用，但其凋亡機(jī)制方面未見有文獻(xiàn)報(bào)告，故本實(shí)驗(yàn)以此為基礎(chǔ)，研究蛇床子素對白血病細(xì)胞的作用及作用機(jī)制，旨在發(fā)現(xiàn)一種效果好并且毒副作用小的新型白血病治療藥物，并為今后相關(guān)方面的研究提供理論依據(jù)。
　　方法:取對數(shù)期生長的HL-60細(xì)胞建立蛇床子素誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的模型，利用淋巴細(xì)胞分離液分離提取白血病病人人新鮮骨髓中的白血病細(xì)胞，CCK8方法檢測細(xì)胞增殖情況，Hoechst33342染色觀

3、察細(xì)胞凋亡前后細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡前后凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平變化，蛋白質(zhì)印記(Western bolt)方法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化，采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，測定數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，t檢驗(yàn)用于均數(shù)比較，不同組間比較采用單向方差分析，以p＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性。
　　結(jié)果:CCK8實(shí)驗(yàn)測得蛇床子素對HL-60細(xì)胞株

4、及人骨髓白血病細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用(p＜0.05)，對人白血病抑制作用不及HL-60細(xì)胞明顯，均具有劑量依賴性。倒置顯微鏡下可見藥物作用后細(xì)胞出現(xiàn)凋亡小體等凋亡形態(tài)學(xué)改變，Hoechst33342染色亦可見誘導(dǎo)凋亡后的HL-60細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變（固縮、邊集、碎裂）。流式細(xì)胞術(shù)檢測得到蛇床子素短時(shí)間即可誘導(dǎo)HL-60出現(xiàn)早期凋亡(p＜0.05)，RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，凋亡的HL-60細(xì)胞其Bax、Caspase3 mR

5、NA表達(dá)上調(diào)，Bcl-2 mRNA表達(dá)下調(diào)Caspase9 mRNA無明顯改變。Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白，cleavedCaspase3、Caspase8、Caspase9、Fas、FasL、Bax目的蛋白表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)下降。上述改變均與細(xì)胞凋亡過程中的分子改變相符。
　　結(jié)論:蛇床子素有抑制白血病細(xì)胞增殖并且誘導(dǎo)凋亡的作用，對HL-60細(xì)胞株及從人新鮮骨髓中分離得到的白血病細(xì)胞均有效，并且其在短

6、時(shí)間內(nèi)即可引起細(xì)胞凋亡，效果較強(qiáng)。已知細(xì)胞凋亡分為內(nèi)源性途徑（線粒體/細(xì)胞色素C介導(dǎo)的通路）和外源性途徑（死亡受體通路），Bcl-2、Bax、Caspase9為細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑的主要作用分子，外源性凋亡途徑主要涉及Fas、FasL、Caspase8的分子表達(dá)改變。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HL-60細(xì)胞凋亡過程中，出現(xiàn)明顯的Bcl-2、Bax、Caspase9、Fas、FasL、Caspase8、Caspase3的mRNA及對應(yīng)的蛋白分子表達(dá)變化與內(nèi)、