BVDV誘導(dǎo)MDBK細(xì)胞產(chǎn)生凋亡的分子機(jī)制研究.pdf

1、[目的]牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)屬于黃病毒科瘟病毒屬的負(fù)鏈RNA病,該病毒主要引起腹瀉、持續(xù)性感染、免疫抑制和母畜流產(chǎn)等主要癥狀。目前隨著我國養(yǎng)牛業(yè)的快速發(fā)展,給我國的畜牧業(yè)發(fā)展帶來了嚴(yán)重?fù)p失。根據(jù)BVDV能否在培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生致細(xì)胞病變的效應(yīng),將其分為致細(xì)胞病變BVDV(cpBVDV)和非致細(xì)胞病變BVDV(ncpBVDV)兩種生物類型,其中cpBVDV能夠使宿主細(xì)胞產(chǎn)生凋亡

2、。探討cpBVDV誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生凋亡的機(jī)制有助于我們開發(fā)針對病毒感染高效的生物治療方法。
　　[方法](1)構(gòu)建MDBKCs和BMDBKCs兩個樣品的cDNA文庫,結(jié)合Solexa高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)方法鑒定miRNA的表達(dá)譜,利用qRT-PCR對表達(dá)差異顯著的miRNA(miR-129-3p、miR-33a、miR-532、bno-miR-2、bno-miR-69和bno-miR-160)進(jìn)行驗(yàn)證;
　　(2)熒光

3、顯微鏡觀察cpBVDV感染的MDBK細(xì)胞形態(tài)變化,利用流式細(xì)胞儀檢測感染細(xì)胞凋亡率;
　　(3)利用qRT-PCR檢測cpBVDV感染的MDBK細(xì)胞中miR-33a的表達(dá)水平;
　　(4)利用Targetscan軟件預(yù)測miR-33a的靶基因,構(gòu)建重組載體pMD18-MAP3K3 3'UTR和雙熒光素酶重組表達(dá)載體pmirGLO-MAP3K3 3'UTR,限制性核酸內(nèi)切酶SACI/XHOI進(jìn)行雙酶切鑒定并測序,雙熒光素酶基因

4、檢測法進(jìn)行靶基因驗(yàn)證;
　　(5)qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染miR-33a NC(陰性對照)和miR-33a mimics的MDBK細(xì)胞中miR-33a的表達(dá)水平;
　　(6)采用qRT-PCR和Western blot分別檢測靶基因MAP3K3和抗凋亡基因BCL-2的轉(zhuǎn)錄水平以及蛋白水平;
　　(7)利用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡率。
　　[結(jié)果](1)鑒定出221個已注釋miRNAs和239個新miRNAs以及

5、miRNAs的表達(dá)譜,qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與Solexa高通量測序結(jié)果基本一致;
　　(2)cpBVDV感染的MDBK細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,細(xì)胞凋亡率隨感染時間延長而升高;
　　(3)cpBVDV感染的MDBK細(xì)胞中miR-33a的表達(dá)水平升高;
　　(4)獲得miR-33a的靶基因MAP3K3,重組載體pMD18-MAP3K3 3'UTR和雙熒光素酶重組表達(dá)載體pmirGLO-MAP3K3 3'UTR構(gòu)建成功,miR-

6、33a可直接靶向MAP3K3;
　　(5)轉(zhuǎn)染miR-33a mimics的MDBK細(xì)胞中miR-33a的表達(dá)水平隨時間延長而升高;
　　(6)轉(zhuǎn)染miR-33a mimics的MDBK細(xì)胞中靶基因MAP3K3和抗凋亡基因BCL-2的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均顯著降低;
　　(7)轉(zhuǎn)染miR-33a mimics的細(xì)胞凋亡率明顯升高。
　　[結(jié)論]以上結(jié)果表明miRNA-33a通過靶向MAP3K3并作用于下游的抗凋亡基