腺苷誘導肝癌BEL-7404細胞凋亡的分子機制研究.pdf

1、背景：
　　腺苷全稱腺嘌呤核苷，是一種廣泛存在于細胞內(nèi)外的重要信號分子，參與調(diào)節(jié)細胞的多種生理生化功能，在循環(huán)和神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)細胞外的腺苷具有細胞毒作用，它可通過腺苷受體或腺苷轉(zhuǎn)運體激活多種死亡途徑誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡，因此近年來已成為抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點。線粒體是生物能量代謝和發(fā)生氧化磷酸化的主要場所，是細胞中產(chǎn)生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)和活性氧(Reactiv

2、e Oxygen Species，ROS)的一個重要部位，越來越多的研究顯示線粒體在介導細胞凋亡的過程中發(fā)揮了極為重要的作用。
　　我們前期研究發(fā)現(xiàn)腺苷可通過激活Caspase-8/9/3誘導肝癌Huh-7、HepG2細胞發(fā)生Caspase依賴的凋亡;此外，腺苷還可通過上調(diào)AMID表達，促AMID從胞漿入核，誘導肝癌Huh-7細胞發(fā)生非Caspase依賴的凋亡。另有研究報道，一些化療藥物可通過增加細胞內(nèi)ROS水平誘導細胞凋亡。然而

3、，腺苷是否通過線粒體途徑誘導肝癌細胞凋亡以及ROS是否參與介導腺苷誘導的細胞凋亡目前仍未見報道。
　　目的：
　　探討腺苷在肝癌研究中的意義，明確腺苷是否能夠通過線粒體依賴的途徑介導肝癌細胞凋亡，以及ROS在腺苷誘導的腫瘤細胞凋亡中的作用，以期闡明腺苷抗腫瘤的新機制。
　　方法：
　　1.通過CCK-8細胞活性檢測及結(jié)晶紫染色的方法檢測腺苷對肝癌BEL-7404細胞增殖的影響。2.用流式細胞儀檢測腺苷對BEL-7

4、404細胞周期的影響。3.運用Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡的發(fā)生。4.利用Western blot、線粒體膜電位檢測、細胞線粒體分離等一系列實驗技術(shù)探尋腺苷誘導肝癌BEL-7404細胞凋亡的分子機制。5.通過流式細胞術(shù)檢測胞內(nèi)ROS水平。6.聯(lián)合使用ROS抑制劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)及腺苷處理細胞后檢測細胞ROS水平、線粒體膜電位變化、細胞色素C(Cytochrome C，Cyt

5、o C)的釋放以及細胞凋亡的發(fā)生。
　　結(jié)果：
　　1.腺苷能顯著抑制肝癌BEL-7404細胞的增殖。2.腺苷能誘導BEL-7404細胞出現(xiàn)sub-G1期凋亡峰及發(fā)生明顯的G2/M期阻滯。3.運用Annexin V/PI雙染法證實腺苷能夠誘導BEL-7404細胞發(fā)生凋亡且以晚期凋亡為主。4.研究發(fā)現(xiàn)腺苷上調(diào)促凋亡蛋白Bak，下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-xl和Mcl-1的表達，使線粒體膜電位下降，線粒體間隙蛋白（SMAC/DIABL

6、O，Cyto C，凋亡誘導因子(Apoptosisinducing afctor, AIF)）釋放入胞漿，通過不同信號轉(zhuǎn)導途徑，激活Caspase級聯(lián)反應，導致細胞凋亡。5.腺苷能顯著增加BEL-7404細胞內(nèi)的ROS水平，呈劑量和時間依賴性。6.抑制ROS的生成可以逆轉(zhuǎn)腺苷誘導的線粒體膜電位下降、CytoC的釋放以及細胞晚期凋亡。
　　結(jié)論：
　　研究證實，腺苷通過誘導肝癌BEL-7404細胞凋亡抑制其增殖;發(fā)現(xiàn)腺苷通過線