N,N-二(2-氯乙基)-芥酸酰胺逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞BEL-7404耐藥及其逆轉(zhuǎn)機制的研究.pdf

1、目的：本研究的研究對象為人肝癌細胞BEL-7404經(jīng)多柔比星誘導建立的人肝癌BEL-7404多柔比星耐藥細胞，觀察N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺對人肝癌耐藥細胞的作用并探討其可能存在的逆轉(zhuǎn)腫瘤BEL-7404耐藥機制。
　　方法：1.耐藥細胞系的建立
　　誘導建立人肝癌BEL-7404細胞多柔比星耐藥細胞株時應(yīng)用大劑量沖擊和濃度梯度遞增間隙作用結(jié)合方法，應(yīng)用MTT法測定該耐藥細胞株與其凍存3個月后的耐藥指數(shù)以檢測該耐藥細

2、胞株的耐藥穩(wěn)定性；RT-PCR法檢測親本細胞與耐藥細胞的ABCB1/Pg-p、ABCC1/MRP1、GST-πmRNA的表達。
　　2. N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞BEL-7404耐藥機制的研究
　?。?）采用MTT法測定N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺、維拉帕米與ADM聯(lián)合應(yīng)用時的藥物濃度。并計算N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺協(xié)同多柔比星對耐藥細胞的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。
　?。?）應(yīng)用細胞免疫化學法觀

3、察N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺、N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺與ADM聯(lián)合應(yīng)用下BEL-7404/ADM細胞多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）的表達。
　?。?）應(yīng)用RT-PCR法檢測N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺作用下、N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺與ADM聯(lián)合應(yīng)用下BEL-7404/ADM細胞的ABCB1/Pg-p、ABCC1/MRP1、GST-πmRNA的表達，以初步探討N，N－二(2-氯乙基)

4、－芥酸酰胺逆轉(zhuǎn)BEL-7404/ADM細胞耐藥的機制。
　?。?）Western blot法檢測N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺作用后耐藥細胞GST-π的表達。
　　結(jié)果：1.成功建立了人肝癌BEL-7404細胞多柔比星耐藥細胞株BEL-7404/ADM，BEL-7404/ADM細胞的耐藥指數(shù)(RI)為15.4091；凍存3個月復蘇后,多柔比星對BEL-7404/ADM的IC50為（28.3103±0.67）μg/ml,R

5、I值為12.54，該耐藥細胞株具有相對穩(wěn)定的耐藥性（P>0.05）；BEL-7404/ADM細胞中ABCB1/Pg-p、ABCC1/MRP1、GST-π基因的表達均顯著高于親本BEL-7404細胞（P<0.05）。
　　2.(1) N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺對BEL-7404耐藥細胞的無毒劑量為250μg/ml，ADM對BEL-7404/ADM的IC50為（34.7880±3.83）μg/ml；N，N－二(2-氯乙基)－芥

6、酸酰胺聯(lián)合ADM后對ADM的IC50為(10.8238±0.27)μg/ml，耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為3.214。
　　（2）細胞免疫化學法檢測結(jié)果顯示：N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺組可下調(diào)BEL-7404/ADM中GST-π的表達（P<0.05），與親本細胞對照組、耐藥細胞對照組相比給以N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺組GST-π蛋白的表達低于耐藥細胞對照組但是高于親本細胞對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而對GST-α

7、、ABCC1/MRP1蛋白表達無影響（P>0.05）。
　?。?）RT-PCR結(jié)果顯示：N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺組可下調(diào)BEL-7404/ADM中GST-πmRNA的表達，與親本細胞對照組、耐藥細胞對照組相比給以N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺組GST-πmRNA的表達低于耐藥細胞對照組但是高于親本細胞對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與單用N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺組、單用ADM組相比，聯(lián)用組ABC

8、C1/MRP1、ABCB1/Pg-p mRNA表達無明顯變化，差異不具有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　(4) Western blot法檢測結(jié)果顯示： N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺組可下調(diào)BEL-7404/ADM中GST-π蛋白的表達（P<0.05），與親本細胞對照組、耐藥細胞對照組相比給以N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺組GST-π蛋白的表達低于耐藥細胞對照組但是高于親本細胞對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）

9、。
　　結(jié)論：1.采用濃度梯度遞增間隙作用與大劑量沖擊結(jié)合方法誘導建立人肝癌BEL-7404細胞ADM耐藥細胞株，該耐藥細胞株的耐藥機制與ABCB1/Pg-p、ABCC1/MRP1過量表達有關(guān)，使用二者結(jié)合方法建立的耐藥細胞株耐藥性相對比較穩(wěn)定。
　　2. N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺抑制BEL-7404/ADM細胞增殖的作用不夠顯著，無細胞毒作用的N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺與ADM聯(lián)合應(yīng)用可顯著增加BEL-7