黃連素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞自噬與凋亡及分子機制研究.pdf

1、肝癌在惡性腫瘤中占六分之一，且因極差的預(yù)后成為世界上第三大死亡原因。而目前化學(xué)治療的結(jié)果不能令人滿意，從具有抗癌活性的中(植物)藥中提取、純化有效的抗腫瘤成分，成為世界醫(yī)學(xué)研究的熱點。
　　黃連素是一種異喹啉類的生物堿，它在眾多藥用植物種屬中占有很重要的地位。近來人們研究發(fā)現(xiàn)黃連素有抗腫瘤的作用，并通過不同機制在體內(nèi)和體外發(fā)揮其抗癌性。大量的實驗證實黃連素有抗腫瘤的作用是在對很多腫瘤細(xì)胞本身的影響上，主要是通過抑制細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)

2、細(xì)胞凋亡以及阻止細(xì)胞周期的方式。還有研究報道黃連素在體內(nèi)可以輔助化療藥物降低副作用以抗腫瘤。由于黃連素取自黃連的干燥根莖，且在中醫(yī)看來黃連歸肝、胃、小腸經(jīng)，瀉火解毒作用極強，與其他同類藥用植物比偏于治療中焦，而肝臟則位于中焦，肝癌為“肥氣”，因此，我國臨床上治療肝癌常有以黃連為君藥的三黃湯及黃連解毒湯等的報道。這給了我們一個新的思路，用黃連提取物來研究對肝癌的影響是否能有新發(fā)現(xiàn)，而其機制也仍然需要我們進(jìn)一步闡明。
　　CD147，

3、一種糖化免疫球蛋白中在肝癌內(nèi)具高表達(dá)的超蛋白，已被確定為有前途的治療癌癥化療的參考指標(biāo)。體外研究表明，CD147可促進(jìn)腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移及血管新生，抑制細(xì)胞凋亡和壞死并賦予癌細(xì)胞抵抗某些化療的耐藥性。最近的一項研究表明，CD147在肝癌中的細(xì)胞自噬和自噬性細(xì)胞死亡的抑制性調(diào)節(jié)中起了重要作用。然而，CD147是否參與黃連素抗腫瘤作用未見報道。因此，本課題擬研究黃連素是否誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的死亡以及黃連素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡的分子機制，即CD147分子是

4、否參與調(diào)節(jié)黃連素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
　　我們采用不同濃度的黃連素誘導(dǎo)兩種人肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC7721，發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)自噬性死亡和凋亡,并從黃連素對CD147的作用方面探討了自噬與凋亡的可能機制。自噬性細(xì)胞死亡是近年來新發(fā)現(xiàn)的另一型程序性細(xì)胞死亡方式。當(dāng)細(xì)胞處于如饑餓、乏氧等惡劣環(huán)境時，可通過適度的自噬降解自身產(chǎn)物滿足生存基本物質(zhì)與能量需求；但過度自噬又將導(dǎo)致細(xì)胞自噬性死亡。新近有研究證實，腫瘤在無血管新生成之前期，乏氧腫瘤的環(huán)

5、境亦可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生自噬；黃連素可以通過Rho/ROCK途徑來抑制肝癌細(xì)胞生長。這些都為我們研究抗腫瘤藥物提供了新方向，即觀察藥物是否能促使腫瘤細(xì)胞引起自噬，以及是否能導(dǎo)致細(xì)胞最終發(fā)生自噬性死亡。
　　本實驗分為三部分：
　　第一部分：黃連素抑制肝癌細(xì)胞細(xì)胞活性的時間依賴性和劑量依賴性的研究
　　選取兩種肝癌細(xì)胞（HepG2、SMMC7721），采用MTT法證實黃連素對兩種肝癌細(xì)胞均具有細(xì)胞毒性作用。然后分別用0,3

6、1.25,62.5,125,250和500μM的不同濃度黃連素對HepG2和SMMC7721肝癌細(xì)胞處理24h，采用MTT法檢測不同濃度下的肝癌細(xì)胞的活性變化。根據(jù)上述檢測結(jié)果選取含有62.5μM濃度的黃連素的培養(yǎng)液分別處理兩種肝癌細(xì)胞，在0，24，48，72和96h后，采用MTT檢測不同時間肝癌細(xì)胞的活性變化。結(jié)果表明，黃連素對HepG2和SMMC7721肝癌細(xì)胞在濃度為0,31.25,62.5125,250,500μM及62.5μM

7、濃度下培養(yǎng)0,24,48,72,96h后具顯著的時間依賴性和劑量依賴性。
　　第二部分：黃連素誘導(dǎo)兩種肝癌細(xì)胞自噬和凋亡的研究
　　本實驗分兩個步驟：首先，運用熒光技術(shù)檢測黃連素是否誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬以及用透射電子顯微鏡（TEM）檢測自噬。1）我們選用SMMC7721肝癌細(xì)胞作為研究黃連素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬的細(xì)胞模型。將pEGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SMMC7721肝癌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后，將細(xì)胞分為六個實驗組，分別用0,31.25,

8、62.5,125,250，500μM的黃連素培養(yǎng)24h，用熒光顯微鏡觀察綠色的EGFP-LC3點狀陽性細(xì)胞以證明黃連素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬。研究表明，黃連素這種誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬的現(xiàn)象是存在的，而且是劑量依賴性的；2）將SMMC7721和HepG2兩種肝癌細(xì)胞分為對照組和黃連素處理組，采用0μM和500μM黃連素培養(yǎng)兩種細(xì)胞24h，分別收集細(xì)胞，用透射電子顯微鏡檢測自噬的特異性標(biāo)志物—自噬泡的形成，結(jié)果顯示：在黃連素處理組，發(fā)現(xiàn)大量自噬泡

9、和凋亡小體共同存在，表明黃連素不僅誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生了自噬而且誘導(dǎo)其發(fā)生了凋亡。接下來為了證明黃連素可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬性細(xì)胞死亡和凋亡，我們分別使用自噬特異性抑制劑3-methyladenine（3-MA）和凋亡的抑制劑z-DEVD-fmk，同時使用不增加抑制劑的對照，采用臺盼蘭染色的方法，計算細(xì)胞的死亡率。研究發(fā)現(xiàn)，這兩種抑制劑都可以分別有效抑制黃連素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。這進(jìn)一步證明了黃連素既可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的自噬性細(xì)胞死亡，又可以誘導(dǎo)肝

10、癌細(xì)胞的凋亡。
　　第三部分：黃連素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬性死亡與凋亡的分子機制
　　已有的研究表明CD147在SMMC7721細(xì)胞中可以抑制饑餓誘導(dǎo)的自噬性細(xì)胞死亡，黃連素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬性死亡與凋亡是否通過CD147的表達(dá)途經(jīng)有待證實。實驗分兩個步驟：第一：通過WesternBlot方法檢測HepG2、SMMC7721肝癌細(xì)胞在不同濃度黃連素的作用下CD147分子的表達(dá)變化。結(jié)果表明隨著黃連素濃度的提高，CD147表達(dá)呈明顯降