重組創(chuàng)傷弧菌溶細胞素誘導THP-1細胞凋亡分子機制的初步研究.pdf

1、目的：
　　 1、研究重組創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(recombinantVibriovulnificushemolysin，rVvhA)對人單核細胞白血病細胞(THP-1)的細胞毒性作用。
　　 2、研究重組創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(rVvhA)對人單核細胞白血病(THP-1)細胞內(nèi)Ca2+濃度的影響并了解其機制。
　　 3、為進一步了解和明確創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(Vibriovulnificushemolysin，rVvhA)的

2、分子致病機制研究提供科學依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、IPTG誘導含pET-28a(+)vvhA重組質(zhì)粒的BL21大腸桿菌表達創(chuàng)傷弧菌溶細胞素融合蛋白rVvhA，SDS-PAGE分析其表達產(chǎn)物。其中以包涵體形式表達的蛋白質(zhì)用三步洗滌結(jié)合Ni2+親和層析法對rVvhA進行純化，純化后采用復性液與分步透析相結(jié)合的方法復性蛋白質(zhì)?；钚詒VvhA冷凍干燥成粉末于-70℃保存。
　　 2、不同濃度活性rVvhA作用THP

3、-1，CCK-8法檢測rVvhA對THP-1細胞生長的抑制作用；普通光學顯微鏡觀察細胞的形態(tài)變化；激光掃描共聚焦顯微鏡結(jié)合Fluo-3AM鈣離子熒光探針測定rVvhA作用THP-1細胞瞬間胞內(nèi)鈣離子濃度變化，并檢測細胞外鈣離子螯合劑(EGTA)和細胞內(nèi)鈣離子螯合劑(BAPTA/AM)對胞內(nèi)鈣離子濃度變化的影響；AnnexinV-FITC/PI標記法結(jié)合流式細胞儀檢測THP-1細胞凋亡及壞死的情況，并檢測EGTA和BAPTA/AM對THP

4、-1細胞凋亡及壞死的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、含pET-28a(+)vvhA重組質(zhì)粒的BL21大腸桿菌經(jīng)0.5mmol/LIPTG誘導后表達的融合蛋白Mr約為54kDa，SDS-PAGE結(jié)果與該融合蛋白的理論推算值相符，表達的蛋白質(zhì)經(jīng)三步洗滌后，再經(jīng)Ni2+-NTA柱純化，其純度達93％左右。純化后樣品經(jīng)復性后證明具有溶血活性，溶血活性為0.2mg蛋白/HU。
　　 2、CCK-8實驗結(jié)果表明，rVvhA活

5、性蛋白能顯著降低THP-1細胞的存活率，并呈現(xiàn)劑量依賴性。0.7HU/mlrVvhA的抑制率是59.87％。rVvhA作用后細胞內(nèi)鈣離子濃度瞬間明顯增加，細胞分別經(jīng)胞外鈣離子螯合劑(EGTA)和胞內(nèi)鈣離子螯合劑(BAPTA/AM)處理后，BAPTA/AM處理組細胞內(nèi)鈣離子熒光強度升高幅度較EGTA處理組明顯增高。流式細胞儀測定結(jié)果可見0.3HU/ml和0.5HU/mlrVvhA可分別誘導THP-1細胞發(fā)生明顯凋亡，凋亡率分別為(4.58

6、3±0.467)％和(9.400±2.374)％。0.7HU/mlrVvhA可誘導THP-1細胞發(fā)生明顯壞死。EGTA和BAPTA/AM不抑制rVvhA誘導的細胞凋亡。
　　 結(jié)論：
　　 rVvhA對THP-1有細胞毒性作用，抑制細胞增殖，且呈劑量依賴性；rVvhA作用THP-1細胞后可引起細胞內(nèi)鈣離子濃度瞬間明顯升高，且升高的鈣離子可能主要源于細胞外鈣離子內(nèi)流；rVvhA可以誘導THP-1細胞發(fā)生凋亡和壞死，細胞外鈣