淋球菌NspA重組蛋白誘導(dǎo)THP-1釋放促炎細(xì)胞因子及細(xì)胞凋亡的作用.pdf

1、目的：構(gòu)建pGEX-6p-1/nspA原核重組載體，表達(dá)并純化GST-NspA重組蛋白，探討NspA誘導(dǎo)人單核細(xì)胞（THP-1）產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α和HMGB1的潛在能力及其誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡程度的影響。
　　方法：通過(guò)Genbank獲取淋球菌NspA蛋白的基因序列，以WHO-E株全基因組DNA為模板，通過(guò) PCR擴(kuò)增得到目的片段，雙酶切后連接到原核表達(dá)載體pGEX-6p-1質(zhì)粒上，經(jīng)測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主

2、菌 E.coli BL-21中，分別用IPTG濃度為0.2、0.5、0.8、1.0、1.2mmol/L，在不同溫度下（13℃、20℃、25℃、30℃、37℃）誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；采用SDS-PAGE分析和Western blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物，GST-Bind?樹脂柱純化重組蛋白，經(jīng)BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度，用多粘菌素B去除純化蛋白中的內(nèi)毒素。以不同濃度NspA重組蛋白刺激THP-1分別作用不同的時(shí)長(zhǎng)，采用ELISA法檢測(cè)THP-1

3、分泌促炎細(xì)胞因子HMGB1、IL-1β和TNF-α的水平。用不同濃度的NspA處理 THP-1細(xì)胞，經(jīng)AnnexinV-EGFP-PI雙染法染色后，用熒光顯微鏡觀測(cè)在不同刺激時(shí)間下的細(xì)胞凋亡形態(tài)上的變化，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：PCR擴(kuò)增出淋球菌WHO-E株NspA基因目的片段，構(gòu)建pGEX-6p-1/nspA原核重組載體，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定證實(shí)與GenBank上GI：215260662序列完全一致。在IPTG濃度

4、為0.8mmol/L、25℃誘導(dǎo)4.5h可得到重組表達(dá)菌表達(dá)NspA可溶性蛋白的最佳狀態(tài)，獲得了相對(duì)分子量約為44kDa的重組蛋白，選取菌體超聲后的上清，經(jīng)GST-Bind?樹脂柱親和純化后得到NspA純化蛋白；經(jīng)BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度為463μg/mL，經(jīng)多粘菌素B處理重組蛋白去除內(nèi)毒素后，鱟試驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)毒素含量小于0.05EU/mL。2、4、8、16、32μg/mL的NspA重組蛋白均能誘導(dǎo)THP-1產(chǎn)生不同水平的IL-1β、TNF

5、-α和HMGB1，并呈劑量依賴性，同時(shí)也隨著刺激時(shí)長(zhǎng)的增加而變化。NspA的刺激濃度在8μg/mL作用48h時(shí)，TNF-α的量達(dá)到138pg/mL的峰值，與PBS/GST對(duì)照組及其它各平行組之間比較均有顯著差異(P<0.05)。在NspA刺激濃度4μg/mL作用時(shí)長(zhǎng)24h時(shí)、8μg/mL刺激48h時(shí)，IL-1β分別達(dá)到約56pg/mL的峰值，與PBS/GST對(duì)照組及其它各平行組之間比較均有顯著差異(P<0.05)。HMGB1的分泌量隨時(shí)

6、間的延長(zhǎng)而增加，在NspA刺激60h時(shí)，HMGB1的分泌量達(dá)到峰值，與PBS/GST對(duì)照組及其它各平行組之間比較均有顯著差異(P<0.05)。用4、8、16、32、64μg/mL NspA重組蛋白刺激THP-1細(xì)胞作用不同的時(shí)間梯度，經(jīng)AnnexinV-EGFP-PI雙染法染色后熒光顯微鏡觀察，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)及蛋白刺激濃度的升高，凋亡的細(xì)胞明顯增多。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)及蛋白刺激濃度的升高，細(xì)胞

7、凋亡百分率有明顯的變化，在刺激蛋白濃度為16μg/mL作用24h的時(shí)候凋亡百分率達(dá)到峰值為18.27％，與PBS/GST對(duì)照組及其它各平行組比較均有顯著差異(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了pGEX-6p-1/NspA原核表達(dá)載體，制備出可溶性的高純度NspA重組蛋白。
　　2.NspA重組蛋白能促進(jìn)THP-1細(xì)胞分泌炎癥因子IL-lβ、TNF-α、HMGB1。
　　3.NspA重組蛋白能誘導(dǎo)TH