EGb761對LPS誘導THP-1細胞釋放HMGB1蛋白表達的調節(jié).pdf

1、研究背景:在ICU患者中膿毒癥為主要死亡原因之一，總體死亡率大約為30％-40％，而在老年患者或者伴隨有其他基礎疾病的患者中死亡率超過70％。根據新的流行病學調查，在美國統(tǒng)計重癥膿毒癥的發(fā)病率大約為千分之三，大約一半發(fā)生在ICU病房以外，40％的膿毒癥病人死于醫(yī)院，膿毒癥休克死亡率最高，可達到50％。國內外相關學者在膿毒癥發(fā)病機制方面也開展了大量的基礎實驗和臨床試驗研究，但是至今仍沒有達到一個共識結論。傳統(tǒng)認為過度的炎癥細胞和介質激活是

2、膿毒癥導致臟器損傷的主要原因，但是近期國內外相關學者卻發(fā)現HMGB1蛋白是膿毒癥的晚期介質，其中在大部分膿毒癥患者中會升高。HMGB1由激活的免疫細胞合成，可與TLR-2、TLR-4發(fā)生關聯，從而啟動與LPS類似的炎癥反應。HMGB1還會引起凝血因子和中性粒細胞的聚集，與促炎細胞因子IL-1等相比，LPS刺激HMGB1的釋放發(fā)生于相對較晚的階段。盡管HMGB1在嚴重膿毒癥患者中升高，但是其對膿毒癥的預后并沒有預測意義。向實驗小鼠注射HM

3、GB1是致命的，而用HMGB1抗體對內毒素和盲腸結扎穿孔小鼠具有一定治療作用，因此推斷HMBG1可能是膿毒癥治療的新靶點。
　　中藥銀杏葉提取物(extract of Ginkgobiloba，EGb761)是從銀杏葉中提取的天然活性物質，其中主要有效成分為黃酮糖苷類(24％)和菇烯內醋類(6％)，EGb761也是一類純天然抗氧化劑，調節(jié)多種抗氧化酶活性，具有抗炎、抗癌、抗衰老、抑制血小板聚集等多種藥理活性。也有研究表明EGb76

4、1對早期炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的有一定的抑制作用，國外有文獻報道EGb761能夠減輕LPS誘導的急性肺損傷，但目前國內外尚未有EGb761對HMGB1蛋白影響的研究。
　　目的:本實驗通過體外培養(yǎng)THP-1細胞，觀察銀杏葉提取物EGb761對LPS誘導THP-1細胞釋放HMGB1蛋白表達的調節(jié)。為進一步實驗及以后臨床運用提供可行的依據。
　　材料與方法:1.實驗細胞及分組
　　1.1 THP-1細胞的

5、培養(yǎng)
　　將分離的細胞收入離心管中，1000r/min，離心10min棄上清，用含20％ FBS的RPMI1640培養(yǎng)液混勻細胞，調整細胞密度至(110-115)×106/cm2，種入培養(yǎng)皿，在37℃，5％條件下CO2培養(yǎng);次日換液，以后根據細胞生長情況每2-3日換液1次。
　　1.2 將生長良好的THP-1隨機分為5組(n=3)。
　　(1)炎性因子檢測組:THP-1+EGb761(50μg/m1)+LPS(1μg/

6、ml)
　　(2)NF-κB的活化檢測組;THP-1+EGb761(50μg/ml)+LPS(1μg/ml)
　　(3)不同時間點HMGB1蛋白檢測組:THP-1+LPS(1μg/ml)
　　(4)不同濃度EGb761對HMGB1影響檢測組:THP-1+EGb761(50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml)+LPS(1μg/ml)
　　(5)HMGB1核轉位組:THP-1+EGb761(50μg/ml

7、)+LPS(1μg/ml)
　　2.觀察指標
　　2.1 ELISA檢測炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達
　　將稀釋均勻的THP-1細胞培養(yǎng)于24孔板中，每孑加入細胞懸浮液1ml及濃度50μg/ml EGb761預處理2h后，用濃度為1μg/ml LPS誘導（均設3個重復孔）6h和12h，吸取培養(yǎng)上清液，按ELISA試劑盒說明書操作。用酶標儀于450nm波長下檢測IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。<

8、br>　　2.2 Western blotting檢測NF-κB的活化
　　將稀釋均勻的THP-1細胞培養(yǎng)于24孔板中每孔加入細胞懸浮液1ml及濃度50μg/ml EGb761預處理2h后用濃度為1μg/mL LPS誘導（均設3個重復孔）4h、6h和12h后，裂解離心提取上清液并提取蛋白，在4℃一抗孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG(1∶5000稀釋)孵育，采用化學發(fā)光顯色法，以目的條帶和β-actin條帶積分光密度值的

9、比值(IOD值)定為目的蛋白的相對表達量。
　　2.3 Western blotting檢測不同時間點HMGB1蛋白的表達
　　將稀釋均勻的THP-1細胞培養(yǎng)于24孔板中每孔加入細胞懸浮液1ml及濃度為1μg/ml LPS誘導（均設3個重復孔）6h、12h、18h后，收集細胞上清液裂解離心提取蛋白，在4℃一抗孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG(1∶5000稀釋)孵育，采用化學發(fā)光顯色法，以目的條帶和β-actin條

10、帶積分光密度值的比值（IOD值）定為目的蛋白的相對表達量。
　　2.4 Western blotting檢測不同濃度EGb761對HMGB1表達影響
　　將稀釋均勻的THP-1細胞培養(yǎng)于24孔板中每孔加入細胞懸浮液1ml，按濃度50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml的EGb761分為三組預處理2h，用濃度為1μg/mlLPS誘導（均設3個重復孔）18h后裂解離心提取蛋白，在4℃一抗孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的山

11、羊抗鼠IgG(1∶5000稀釋)孵育，采用化學發(fā)光顯色法，以目的條帶和β-actin條帶積分光密度值的比值（IOD值）定為目的蛋白的相對表達量。
　　2.5 共聚焦熒光顯微鏡觀察HMGB1蛋白的核轉位
　　將稀釋均勻的THP-1細胞培養(yǎng)于24孔板中每孔加入細胞懸浮液1ml和濃度150μg/mlEGb761預處理2h后，用濃度為1μg/ml LPS誘導（均設3個重復孔）18 h，采用共聚焦顯微鏡熒光法標記，HMGB1蛋白用綠色

12、熒光標記，細胞核用藍色熒光標記為對照，將兩者重疊后在熒光顯微鏡下觀察HMGB1在細胞內分布變化。
　　3.統(tǒng)計學處理
　　各組數據采用均數±標準差(mean±SD)表示并應用統(tǒng)計學軟件SPSS13.0進行處理。采用單因素方差分析不同組別間的比較，以(P＜0.05)為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:1.ELISA檢測炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達
　　ELISA檢測結果表明，LPS誘導THP-1細胞6

13、-12h后，可分泌大量的IL-1β、IL-6、TNF-α炎性因子較空白對照組高(P＜0.05)。培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6、TNF-α濃度明顯增加，經過EGB761干預后，THP-1細胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6、TNF-α濃度較LPS組明顯降低有顯著的差異(P＜0.05)。
　　2.EGb761對不同時間點NF-κB活化檢測
　　Western blotting檢測THP-1細胞經LPS誘導后，NF-κB表達增高，經過

14、EGB761干預2-12h，THP-1細胞培養(yǎng)液中NF-κB含量隨著EGb761干預時間延長較空白對照組呈明顯下降趨勢(P＜0.05)有統(tǒng)計學意義。
　　3.LPS誘導THP-1細胞不同時間段釋放HMGB1蛋白表達變化
　　Western blotting檢測結果顯示:LPS誘導THP-1細胞12h后，細胞上清液中HMGB1蛋白含量較空白組升高，并隨著時間延長18h HMGB1蛋白含量呈明顯升高趨勢(P＜0.05)有統(tǒng)計學意

15、義。
　　4.不同濃度的EGb761對LPS誘導THP-1細胞產生HMGB1蛋白表達的變化
　　Westemblottting檢測結果顯示:EGb761干預LPS誘導THP-1細胞18h后上清液中HMGB1蛋白含量較空白對照組低，HMGB1蛋白含量隨著EGB761濃度增加至150μg/ml呈下降趨勢并呈劑量依賴效應(P＜0.05)有統(tǒng)計學意義。
　　5.EGb761抑制LPS誘導THP-1細胞釋放HMGB1蛋白核轉位<

16、br>　　在共聚焦顯微鏡下顯示:空白組HMGB1幾乎全部分布在核內;LPS誘導組可見HMGB1大部分從細胞核轉移到胞漿中;EGb761和LPS干預組均可見部分HMGB1分布。
　　結論:1.LPS可誘導THP-1細胞IL-1β、IL-6、TNF-α表達增多及NF-κB活化，導致HMGB1蛋白表達增多及核轉位。
　　2.EGB761能抑制THP-1細胞IL-1β、IL-6、TNF-α表達及NF-κB活化，調節(jié)HMGB1蛋白的表