熊果酸對THP1細(xì)胞HMGB1表達(dá)和NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響.pdf

1、目的：研究熊果酸(UrsolicAcid，UA)對THP1細(xì)胞HMGB1表達(dá)水平和NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性的影響。
　　方法：THP1細(xì)胞用小牛血清體積比為10％的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)在50ml的無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，內(nèi)含100U/ml的青霉素和100U/ml的鏈霉素，在37℃、5％ CO2和飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。分別用不同濃度的UA作用細(xì)胞后進(jìn)行相應(yīng)的檢測。(1)MTT:將生長狀態(tài)良好的THP1細(xì)胞接種于96孔板中，另設(shè)空白

2、對照組，1×104個(gè)/孔，共設(shè)5組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。分別加入不同濃度的UA(0.1、1、5、10和20μmol/L)在培養(yǎng)箱中作用24h。MTT檢測細(xì)胞增殖情況。(2)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng):將生長狀態(tài)良好的THP1細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，1×105個(gè)/孔，共設(shè)5組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加入不同濃度UA處理。24h后用Trizol試劑提取細(xì)胞的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴(kuò)增HMGB1和p65基因，判斷細(xì)胞中HMGB1和p65

3、的表達(dá)變化情況。(3)Western blot:將生長狀態(tài)良好的THP1細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，2×106/孔，共設(shè)5組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加入不同濃度UA處理。48h后提取細(xì)胞的總蛋白，用Western blot檢測HMGB1和p65蛋白表達(dá)情況。(4)NF-κB熒光素酶報(bào)告基因檢測:將THP1細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，2×105個(gè)/孔，共設(shè)5組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，按照TfxTM-50 Reagent說明書進(jìn)行操作，質(zhì)粒NF-κB熒光

4、素酶報(bào)告基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，40h后加入不同濃度的UA，48h后測定熒光素酶活性。
　　結(jié)果：(1)UA對細(xì)胞增殖的影響:與對照組相比，20μmol/L UA可明顯抑制THP1細(xì)胞增殖（P＜0.05），其它濃度UA則無明顯影響。(2)UA對細(xì)胞內(nèi)HMGB1和p65的影響:①HMGB1:與對照組相比，1μmol/L的UA對HMGB1 mRNA的表達(dá)有明顯促進(jìn)作用（P＜0.05），其它濃度組與對照組相比變化不大;②p65:與對照組相比，

5、UA1μmol/L刺激組p65 mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。(3)UA對細(xì)胞內(nèi)HMGB1和p65蛋白表達(dá)的影響:①HMGB1:與對照組相比，1μmo/LUA組對HMGB1蛋白表達(dá)水平有明顯增高（P＜0.05），其它濃度組與對照組相比變化不大;②p65:與對照組相比，UA1μmol/L刺激組p65蛋白表達(dá)水平明顯增高(P＜0.05);UA1μmol/L+BAY11-7082作用組p65蛋白表達(dá)比單獨(dú)UA1μmol/L刺激組明顯