熊果酸抑制NF-κB活化防治大鼠靜脈再狹窄的實驗研究.pdf

1、目的：
　　本實驗總共分為三部分，實驗?zāi)康氖菫榱搜芯啃芄釋Υ笫箪o脈再狹窄的影響及機制，同時研究Cuff套管技術(shù)在大鼠靜脈再狹窄模型中的應(yīng)用。
　　(1)兩種自體靜脈移植再狹窄大鼠模型的對比研究:利用大鼠頸外靜脈作為橋血管，分別將頸外靜脈移植至頸總動脈和腹主動脈。建立兩種自體靜脈再狹窄大鼠模型。將兩種模型建立過程和靜脈橋內(nèi)膜和中膜的狹窄情況進行對比研究。研究兩種動物模型在模型建立過程及建立后靜脈橋狹窄情況的異同。
　　

2、(2)熊果酸在大鼠自體靜脈移植再狹窄模型中抑制血管橋增生狹窄的實驗研究:將大鼠的頸外靜脈用Cuff吻合法移植至頸總動脈，建立大鼠靜脈橋再狹窄的動物模型。設(shè)立對照組，實驗組大鼠給予兩種不同劑量的熊果酸，研究不同劑量的熊果酸對靜脈橋不同時期內(nèi)膜、中膜增生的抑制作用，細胞增生及凋亡的影響。
　　(3)熊果酸在大鼠自體靜脈移植再狹窄模型中抑制血管炎癥的實驗研究:將大鼠的頸外靜脈用Cuff吻合法移植至頸總動脈，建立大鼠靜脈橋再狹窄的動物模型

3、。予以熊果酸抑制NF-κB的活化，檢測靜脈橋炎癥反應(yīng)過程中MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α的變化，研究熊果酸抑制靜脈再狹窄作用機制。
　　方法：
　　(1)將30只大鼠隨機分成A、B共2組，每組15只。術(shù)前對實驗大鼠禁食8小時，禁水4小時。均以右側(cè)頸外靜脈作為自體移植靜脈，以Cuff套管法為吻合方法，A組將右側(cè)頸外靜脈移植至右側(cè)頸總動脈，B組移植至腹主動脈，分別建成兩種自體靜脈再狹窄的動物模型。術(shù)后滿第1周、第2

4、周和第4周分三次取材，每次隨機選取5只大鼠。麻醉后從原切口找到靜脈橋，觀察橋靜脈通暢后切取靜脈。取下后用生理鹽水沖洗，4％多聚甲醛沖洗固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片厚度為4μm。隨機選取5個不同位置的切片做HE染色，計算內(nèi)膜、中膜厚度。
　　(2)將45只大鼠隨機分成A、B、C共3組，每組15只。術(shù)前對實驗大鼠禁食8小時，禁水4小時。均以右側(cè)頸外靜脈作為自體移植靜脈，以Cuff套管法為吻合方法，將右側(cè)頸外靜脈移植至右側(cè)頸總動脈。A

5、組為對照組，在靜脈移植至頸總動脈后不予藥物干預(yù)，B組術(shù)后第一天開始予以15mg/(kg·d)熊果酸灌胃，C組術(shù)后第一天開始予以30mg/(kg·d)熊果酸灌胃。在術(shù)后滿第1周、第2周和第4周分三次取出靜脈橋標(biāo)本，每次每組隨機選取5只大鼠，麻醉后從原切口找到靜脈橋，觀察橋靜脈通暢后切取靜脈。切片厚度為4μm。對靜脈橋切片行HE染色、Masson染色、PCNA染色、TUNEL檢測。研究不同劑量的熊果酸對靜脈橋不同時期內(nèi)膜、中膜增生的抑制作用

6、，細胞增生及凋亡的影響。
　　(3)將45只大鼠隨機分成A、B、C共3組，每組各15只。A組為對照組，不作任何處理。B組為模型組，將頸外靜脈移植至頸總動脈后不予藥物干預(yù)。C組為熊果酸組，將右側(cè)頸外靜脈移植至頸總動脈后術(shù)后當(dāng)天開始予以30mg/(kg·d)熊果酸灌胃。B、C組大鼠術(shù)前禁食8小時，禁水4小時。均以右側(cè)頸外靜脈作為自體移植靜脈，以Cuff套管法為吻合方法，將右側(cè)頸外靜脈移植至右側(cè)頸總動脈。B、C組分別在術(shù)后第48h處死大

7、鼠切取移植靜脈，A組取右側(cè)頸外靜脈，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測細胞因子MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α。對比研究3組靜脈細胞因子的含量。
　　結(jié)果：
　　(1)兩組大鼠共30只全部成活，術(shù)后活動、飲食均正常，切口愈合良好。取材時共30條橋靜脈均通暢，搏動良好。兩組大鼠手術(shù)過程順利。B組手術(shù)時間、吻合時間均較A組長，兩組相比P＜0.05，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。兩組大鼠隨著術(shù)后時間的延長，內(nèi)膜和中膜

8、的厚度也逐漸增厚。B組大鼠在1W、2W和4W不同的時間點，內(nèi)膜和中膜的厚度分別與A組相比較，P＞0.05。差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(2)隨著時間的延長，所有靜脈橋的內(nèi)膜和中膜的厚度均有逐漸增厚的趨勢。兩種劑量的熊果酸對內(nèi)膜和中膜的增厚均有不同程度的抑制作用。相對應(yīng)的時間點不管是內(nèi)膜還是中膜的厚度，B組與A組相比P＜0.05，C組與A組相比P＜0.05，C組與B組相比P＜0.05。本實驗表明，每天給予的熊果酸劑量不同，對血管增生的

9、抑制效果也不同。30mg/(kg·d)的熊果酸比15mg/(kg·d)具有更好的抑制內(nèi)膜和中膜增生的效果。
　　3組靜脈橋在不同的時間所取的標(biāo)本內(nèi)膜和中膜均能見到PCNA陽性細胞，兩種不同濃度的熊果酸均具有抑制細胞增殖的作用。相對應(yīng)時間點的細胞增殖指數(shù)，B組與A組相比P＜0.05，C組與A組相比P＜0.05，C組與B組相比P＜0.05。本研究表明，30mg/(kg·d)的熊果酸較15mg/(kg·d)具有更好的抑制內(nèi)膜和中膜細胞增

10、殖的效果。
　　3組靜脈橋在不同的時間所取的標(biāo)本內(nèi)膜和中膜均能見到凋亡細胞。相對應(yīng)時間點的內(nèi)膜細胞凋亡指數(shù)，B組與A組相比P＜0.05，C組與A組相比P＜0.05，C組與B組相比P＜0.05。本研究表明，30mg/(kg·d)的熊果酸比15mg/(kg·d)具有更好的誘導(dǎo)內(nèi)膜細胞凋亡的效果。兩種不同濃度的熊果酸均具有誘導(dǎo)內(nèi)膜細胞增殖的作用。相對應(yīng)的時間點中膜細胞凋亡指數(shù)B組與A組相比P＞0.05，C組與A組相比P＞0.05，C組與

11、B組相比P＞0.05。本研究表明，30mg/(kg·d)和15mg/(kg·d)的熊果酸并沒有誘導(dǎo)中膜細胞凋亡的作用。
　　(3)B組和C組細胞因子MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α均較A組顯著增高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。在術(shù)后應(yīng)用熊果酸組治療的C組較未予熊果酸的B組細胞因子MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α顯著降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　(1)兩種模型均為目前動物實驗中為反映冠狀

12、動脈旁路移植術(shù)后移植靜脈再狹窄病理過程所用的理想模型。Cuff套管法建立大鼠頸外靜脈移植到頸總動脈模型，操作簡單，成功率高，死亡率低，短期內(nèi)無免疫排斥反應(yīng)，有利于開展大規(guī)模的動物實驗。此模型是研究移植靜脈內(nèi)膜增生和狹窄的發(fā)病機制、病理變化及探討其防治措施理想的動物模型。
　　(2)熊果酸能夠抑制靜脈移植后的再狹窄。劑量為30mg/(kg·d)的熊果酸比15mg/(kg·d)具有更好的抑制內(nèi)膜和中膜增殖的效果。劑量為30mg/(kg

13、·d)的熊果酸比15 mg/(kg·d)具有更好的誘導(dǎo)內(nèi)膜細胞凋亡的效果。但30mg/(kg·d)和15mg/(kg·d)的熊果酸并沒有誘導(dǎo)中膜細胞凋亡的作用。
　　(3)在移植靜脈再狹窄的模型中，各種因素導(dǎo)致血管的炎癥，進而引起血管壁重塑是靜脈再狹窄最重要的原因。熊果酸能夠抑制靜脈移植后血管壁的炎癥，有效防治靜脈的再狹窄。熊果酸的作用機制是通過抑制NF-κB的活化，抑制了MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α基因表達。術(shù)后