超聲微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染防治移植靜脈再狹窄的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：探討超聲微泡造影劑結(jié)合超聲輻照能否提高增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因質(zhì)粒（Pegfp）在大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的轉(zhuǎn)染效率，及其對(duì)細(xì)胞活性的影響。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)分為A、B、C、D四組，分別為空白對(duì)照組、單純質(zhì)粒浸泡組、質(zhì)粒+超聲輻照組、質(zhì)粒+超聲輻照+造影劑組。使用診斷超聲儀照射體外培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞，輻照條件為超聲探頭頻率為10MHz，機(jī)械指數(shù)為1.9，輻照時(shí)間為10min，添加或不添

2、加超聲微泡造影劑，Pegfp濃度為5μg/ml, 輻照后臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活性（生存率），48h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）的轉(zhuǎn)染表達(dá)率。
　　 結(jié)果：A、B、C、D四組的細(xì)胞生存率分別為（97.43±2.63）％、（97.52±1.64）％、（96.83±2.31）％及（95.21±1.36）％，各組間無(wú)顯著性差異（P>0.05）；GFP轉(zhuǎn)染表達(dá)率分別為（0.12±0.42）％、（1.31±0.71）％、（4.45

3、±3.13）％及（21.48±2.16）％，D組的GFP轉(zhuǎn)染表達(dá)率與其余各組比較差異具有顯著意義（P<0.01）。
　　 結(jié)論：造影劑微泡結(jié)合超聲輻照能顯著提高Pegfp在VSMC的轉(zhuǎn)染效率，而對(duì)細(xì)胞的活性基本無(wú)影響，可作為基因轉(zhuǎn)染的一種有效方法。
　　 第二部分
　　 目的：探討微泡造影劑及超聲輻照介導(dǎo)內(nèi)皮型一氧氣化氮合成酶（Enos）基因轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的可行性。
　　 方法

4、：實(shí)驗(yàn)分為A、B、C、D、E五組，分別為空白對(duì)照組、單純質(zhì)粒浸泡組、質(zhì)粒+微泡造影劑組、質(zhì)粒+超聲輻照組、質(zhì)粒+超聲輻照+造影劑組。用重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Enos經(jīng)微泡造影劑及超聲輻照介導(dǎo)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞，輻照條件為超聲探頭頻率為10MHz，機(jī)械指數(shù)為1.9，輻照時(shí)間為10min，重組真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1-Enos 5μg/ml。 輻照48h后，采用RT-PCR、Western blot及免疫組

5、化檢測(cè)VSMC內(nèi)eNOSmRNA和蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：RT-PCR檢測(cè)質(zhì)粒+超聲輻照+造影劑組eNOSmRNA的表達(dá)最顯著，IOD比值為(91.11±3.41)％，單純質(zhì)粒浸泡組、質(zhì)粒+微泡造影劑組、質(zhì)粒+超聲輻照組也有少量表達(dá)，IOD比值分別為(26.10±1.32)％、(31.42±2.43)％、(35.05±2.25)％，與E組相比P<0.05。蛋白印跡分析Enos蛋白表達(dá)，空白對(duì)照組有極少量表達(dá)，單純質(zhì)粒浸泡組、質(zhì)

6、粒+微泡造影劑組也有少量表達(dá)，IOD比值分別為(22.12±1.33)％、(25.42±2.41)％、(33.11±3.11)％；而質(zhì)粒+超聲輻照+造影劑組表達(dá)最明顯，IOD比值為(84.22±9.22)％，與各組相比P<0.05。
　　 結(jié)論：超聲輻照結(jié)合造影劑微泡能顯著提高Enos基因在VSMC的轉(zhuǎn)染效率，提高細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合成酶的表達(dá)。
　　 第三部分
　　 目的：探討微泡造影劑結(jié)合超聲輻照介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染移

7、植靜脈橋的可行性。
　　 方法：建立SD大鼠頸外靜脈-頸總動(dòng)脈移植模型，選擇增強(qiáng)型綠色熒光蛋白質(zhì)粒(Pegfp)為報(bào)告基因。將大鼠頸外靜脈段浸泡入粘附質(zhì)粒的微泡中，予超聲照射，再將靜脈段間置植入頸總動(dòng)脈，2d后，取出靜脈段行快速冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察血管平滑肌內(nèi)熒光表達(dá)，同時(shí)進(jìn)行蘇木精-伊紅染色行病理觀察。
　　 結(jié)果：微泡造影劑結(jié)合超聲輻照組的熒光強(qiáng)度顯著高于質(zhì)粒浸泡+超聲輻照組、質(zhì)粒+微泡造影劑組及單純質(zhì)粒浸泡組

8、(P<0.05)。蘇木精-伊紅染色觀察血管組織并無(wú)壞死灶的出現(xiàn)。
　　 結(jié)論：微泡造影劑結(jié)合超聲輻照可以實(shí)現(xiàn)基因靶向轉(zhuǎn)染至大鼠移植靜脈橋的血管平滑肌中。
　　 第四部分
　　 目的：探討微泡造影劑及超聲輻照介導(dǎo)內(nèi)皮型一氧氣化氮合成酶基因轉(zhuǎn)染防治移植靜脈血管橋再狹窄的可行性。
　　 方法：重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Enos經(jīng)微泡造影劑及超聲輻照介導(dǎo)體外轉(zhuǎn)染大鼠頸外靜脈，再將靜脈段間置植入頸總動(dòng)脈，建

9、立SD大鼠頸外靜脈頸總動(dòng)脈旁路移植模型。于術(shù)后四周，取移植靜脈標(biāo)本分別進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，免疫組織化學(xué)染色及Western blot分析，觀察內(nèi)皮一氧化氮合成酶基因在靜脈橋中的功能表達(dá)和靜脈橋新生內(nèi)膜的增生情況。結(jié)果 微泡造影劑及超聲輻照介導(dǎo)內(nèi)皮型一氧化氮合成酶基因轉(zhuǎn)染組的移植血管橋內(nèi)一氧化氮合成酶基因在靜脈橋中的功能表達(dá)明顯強(qiáng)于模型對(duì)照組、單純質(zhì)粒浸泡組、質(zhì)粒+微泡造影劑組及質(zhì)粒浸泡+超聲輻照組；內(nèi)膜增生明顯減弱，再狹窄程度顯著低于