超聲介導微泡空化促基因轉染內皮細胞機制初探.pdf

1、心血管疾病的發(fā)病及死亡在全球高居首位，尤其是在發(fā)達國家，冠心病的實質是因供應不足導致的缺血和缺氧。近幾十年來，經(jīng)過人們的不斷努力取得了許多成就，循證醫(yī)學指導下的新的更為合理的心血管藥物以及以冠狀動脈旁路搭橋術(CABG)和血管成形術(PTCA)為代表的血運重建心肌再灌注療法，使冠心病尤其是急性心肌梗死的治療和預后取得了較大的進步。然而，仍有諸多重要問題未予解決。例如，對于一些由于自身冠狀動脈病變復雜、嚴重、彌散、終末小分枝病變等，則不能

2、進行PTCA和CABG冠脈重建；有些病人雖可進行冠脈重建，但重建后血供仍不充分，缺血心肌瀕臨壞死、凋亡、纖維化；另外PTCA和CABG術后再狹窄問題，使心肌再灌注療法面臨挑戰(zhàn)。因此，尋求其它血運重建策略迫在眉睫，人們寄厚望于稱為“分子搭橋”的治療性血管新生(Therapeuticangiogensis)以及心肌干細胞移植。 缺氧心肌微循環(huán)的代償包括微血管擴張、儲備血管開通、微血管新生及動、靜脈側支形成，嚴重冠心病患者即使在合并使

3、用硝酸酯和鈣拮抗劑等藥物治療基礎上，內源性的促血管生長調節(jié)下的微循環(huán)代償已達極限。因此，在藥物治療、血運重建基礎上，通過輸入外源性的促血管生長因子，促進心肌血管新生(TherapeuticAngiogenesis)、改善心肌缺血即心肌血管分子搭橋，是人們正在努力探索的研究熱點?；蛑委熞呀?jīng)成為治療遺傳性及獲得性疾病的一種重要手段?；騻鬏斢袃煞N載體：病毒與非病毒。盡管病毒載體有高效的傳輸效果，臨床試驗發(fā)現(xiàn)其副作用較大，非病毒載體傳輸越來

4、越受到人們的關注。分子生物學在心血管領域的應用及心肌分子搭橋基因治療的飛速發(fā)展，使分子搭橋已進入臨床并進行初步實踐；如開胸心肌注射VEGF121重組腺病毒、經(jīng)心內膜和心包注射重組VEGF165和VEGF121真核表達質粒、冠脈內注射bFGF、VEGF165進行血運重建的臨床試驗等。這些研究雖然取得了一些令人振奮的效果，但有創(chuàng)、高風險的基因傳輸方式明顯限制了分子搭橋療法的深入開展。 超聲在基因和活性藥物靶向傳輸中的應用是正在興起的

5、研究熱點，其核心是應用超聲波及聲學造影劑微氣泡發(fā)展基因和藥物定向傳輸及釋放技術，即超聲介導微泡空化靶向傳輸系統(tǒng)。該系統(tǒng)的原理是將聲學造影劑微氣泡耦連或包載靶向藥物或基因，使載藥微泡在顯影心肌的同時，利用聲學造影劑微氣泡在超聲場內發(fā)生的空化效應，將基因和藥物運載和釋放到特定的組織和器官，使局部組織達到有效的治療濃度。已有充分研究證實該系統(tǒng)的可行性和應用前景，其全身給藥少、局部濃度高、無創(chuàng)、簡便、并可在床邊進行等優(yōu)點，給予當前靶向性差、正處

6、于低迷狀態(tài)的基因療法以新的希望。 目的： 本研究擬在DNA轉染過程中，利用分子生物學、細胞生物學、DNA免疫熒光標記技術和聲學影像技術，觀察超聲波、微泡空化報告基因轉染內皮細胞的增強作用；探討超聲波、微泡空化對內皮細胞膜的流動性、細胞骨架生物作用，試圖初步闡明超聲介導微泡空化促進內皮細胞基因轉染的細胞和分子機制，探索超聲介導微泡空化轉染基因的優(yōu)化條件，為超聲介導微泡空化靶向心肌傳輸治療基因的“分子搭橋”提供理論依據(jù)和實踐

7、指導。 材料與方法： 1、研究對象及分組 成功取材大鼠肺微血管內皮細胞，實驗過程中6孔板培養(yǎng)細胞，待細胞處于對數(shù)生長期分別轉染與白蛋白微泡孵育的報告基因eGFP質粒，對不同組別的細胞發(fā)射超聲，并進行定量分析報告基因的表達效率，探討靶向微泡的基因傳輸功能；不同條件下超聲照射大鼠肺微血管內皮細胞后，分別對細胞骨架微絲、微管行免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及應用軟件Simplepcr測量熒光強度并進行分析；免疫

8、組化法NBD-C6-HPC探針行細胞膜染色，激光共聚焦顯微鏡觀察應用FRAP技術間接測量不同條件下細胞膜流動性、熒光恢復率的變化，探討細胞膜流動性的改變與細胞轉染率之間的關系。 2、試驗儀器及設備 全氟顯(南方醫(yī)科大學大學藥學部研制)；超聲影像系統(tǒng)Sequoia512(美國Acuson公司)；質粒提取試劑盒購自QIAGEN公司(德國)；DH5a工程菌(本校組織工程與構建實驗室贈)；eGFP質粒(美國Invitrogen公

9、司)；兔抗鼠微管蛋白一抗(美國LabVision公司)；羊抗兔二抗(美國KPL公司)；倒置熒光顯微鏡IX71(日本Olympus公司)，Simplepci熒光分析軟件(美國)；NBD-C6-HPC探針(美國MoleculeProbe公司)；牛血清白蛋白等。 3、試驗方法 (1)超聲介導微泡空化靶向傳輸細胞模型的制備； 取全氟顯(全氟丙烷人血白蛋白微泡注射劑，南方醫(yī)科大學藥學部)凍干制劑1支，用3mL生理鹽水溶解，

10、輕搖至混濁，4℃靜置2h。棄少許上層泡沫懸濁液，加入質粒eGFP至終濃度為100mg/ml，置4℃冰箱2h。培養(yǎng)板中每孔換入含1％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基1.8ml，一組加入200μl微泡質?；旌弦毫硪唤M加入200ml微泡。超聲照射24h后熒光顯微鏡下觀察。 (2)報告基因eGFP的大量制備； 復蘇大腸桿菌DH5a，常規(guī)搖菌擴增，將報告質粒eGFP-c2按氯化鈣法轉入細菌，藍、白菌落篩選法挑選陽性克隆菌落；大量擴

11、增轉化細菌，按試劑盒況明書要求提取質粒，Biophotometer生物分光光度計測質粒濃度為300μg/mL，調整質粒濃度為1mg/mL。 (3)大鼠肺微血管內皮細胞的取材及培養(yǎng)； SD大鼠(南方醫(yī)科大學實驗動物中心，SPF級)，質量130～150g。無菌條件下取肺的邊緣，差速生長分離法去除平滑肌細胞，待內皮細胞純度達95％以上用于實驗。細胞生長至第三代，傳代于6孔板中，處于對數(shù)生長期時用于實驗。 (4)超聲介導

12、微泡空化對大鼠肺微血管內皮細胞細胞骨架的影響； 超聲照射后，免疫組化染色微管、微絲蛋白，倒置熒光顯微鏡IX71(Olympus，日本)檢測并采集熒光圖像，Simplepcr(美國)計數(shù)細胞并進行熒光強度分析。 (5)超聲介導微泡空化對細胞膜流動性的影響； 共聚焦專用培養(yǎng)皿中的細胞超聲照射后，不同條件超聲照射后探針NBD-C6-HPC標記細胞膜，應用激光共聚焦顯微鏡上的frap程序間接測定細胞膜流動性。 結

13、果： 1.順利完成大鼠肺微血管內皮細胞的原代取材及純化；成功建立超聲介導微泡空化靶向傳輸細胞模型。 2.利用超聲介導微泡空化靶向傳輸系統(tǒng)在細胞水平傳輸報告基因，以全氟顯白蛋白微泡進行傳輸時，與其他組相比，陽性對照組可見報告基因eGFP較強表達，報告基因轉染成功，超聲介導微泡空化有明顯促基因轉染細胞的作用。 3.不同MI與照射時間條件下實驗組均能夠熒光細胞。MI為0.50～1.50范圍內，基因轉染率與MI增加呈正相

14、關，MI為1.50～1.80范圍內基因轉染率差別無統(tǒng)計學意義。超聲照射時間為60～90s細胞轉染率差別有統(tǒng)計學意義，但是延長照射時間，細胞轉染差別無統(tǒng)計學意義。 4.利用超聲介導微泡空化靶向傳輸報告基因對細胞骨架無明顯損傷。MI為0.50～1.50范圍內，微管蛋白熒光強度與對照組相比差別有統(tǒng)計學意義，但是MI為1.50～1.80范圍內微管熒光強度差別無統(tǒng)計學意義。超聲照射時間為30～90s范圍內微管蛋白強度改變與照射時間呈正相關

15、，繼續(xù)增加照射時間，微管熒光強度改變無統(tǒng)計學意義。 5.超聲介導微泡空化在一定聲學參數(shù)范圍內使細胞膜流動性改變差別具有統(tǒng)計學意義。 結論： 1.本實驗研究證實超聲介導微泡空化能夠在細胞水平靶向傳輸報告基因，為超聲介導微泡空化靶向傳輸治療性藥物或者基因應用于冠心病治療的可行性提供實驗依據(jù)。 2.超聲介導微泡空化靶向傳輸基因在對細胞形態(tài)及骨架無明顯損傷作用，證實超聲介導微泡空化靶向傳輸?shù)陌踩浴?3.