血小板微泡介導(dǎo)microRNA促進內(nèi)皮細胞凋亡的作用和機制研究.pdf

1、背景:血小板(blood platelet)是哺乳動物血液中特有的成分之一，是從成熟巨核細胞的胞質(zhì)裂解脫落下來的具有生物學(xué)功能的小塊無核胞質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)血小板可以通過分泌微泡，參與免疫、炎癥以及血管新生等重要生理病理進程。MicroRNA(miRNA)是細胞內(nèi)源性的非編碼RNA分子，通過與的抑制靶基因翻譯或促進其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對基因的表達進行調(diào)控。近年來，隨著miRNA功能的重要發(fā)現(xiàn)，微泡miRNA的功能研究也越來越受到重視。

2、r>　　目的:建立完善的血小板微泡分離體系，明確其對內(nèi)皮細胞的作用，并探索微泡miRNA的表達及作用機制。
　　方法:通過正交實驗優(yōu)化血小板分離的離心速度和離心時間，梯度離心獲得富含血小板血漿。超速離心的方法分離純化血小板來源的微泡，并通過透射電鏡確定微泡形態(tài)組成。流式細胞術(shù)結(jié)合CD41a抗體特異性標(biāo)記檢測微泡數(shù)量。激光光散射分析微泡直徑大小。Western blot檢測微泡中CD41、HSP70和MHCⅡ等膜蛋白標(biāo)志物的表達。激

3、光共聚焦顯微鏡結(jié)合CM-DiI標(biāo)記確認內(nèi)皮細胞吸收微泡的狀態(tài)。MTT法確定微泡對內(nèi)皮細胞生長活力和增殖的影響。流式細胞術(shù)結(jié)合AnnexinⅤ-FITC/PI雙標(biāo)記檢測微泡對內(nèi)皮細胞凋亡的影響。平板劃痕修復(fù)實驗檢測微泡對內(nèi)皮細胞遷移的影響。流式細胞術(shù)結(jié)合PI染色檢測微泡對內(nèi)皮細胞生長周期的影響。Elisa的方法檢測微泡對內(nèi)皮細胞分泌內(nèi)皮素1(Endothelin1，ET1)的影響。Griess法檢測微泡對內(nèi)皮細胞分泌NO的影響。利用阿司匹

4、林和凝血酶對血小板進行抑制活化和活化調(diào)節(jié)。實時定量PCR的方法檢測微泡中miRNA的表達水平。生物信息學(xué)分析的方法預(yù)測miRNA的可能靶基因。
　　結(jié)果:
　　(1)通過正交實驗優(yōu)化血小板離心方法，獲得富含血小板的血漿。超速離心的方法純化了血小板分泌的微泡，透射電鏡結(jié)果顯示微泡直徑約50～100 nm，具有膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)含復(fù)雜物質(zhì)組成;流式細胞術(shù)結(jié)果顯示血小板分泌的微泡具有CD41a和膜蛋白陽性表達;激光光散射分析顯示活化的血小

5、板主要分泌直徑為100nm的微泡;Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，微泡中高表達CD41、HSP70和MHCⅡ等膜蛋白標(biāo)志物。
　　(2)微泡經(jīng)CM-DiI標(biāo)記后，通過激光共聚焦顯微鏡可見微泡可被內(nèi)皮細胞吸收，并聚集于其細胞質(zhì)中;微泡刺激內(nèi)皮細胞后，顯著抑制內(nèi)皮細胞增殖和遷移，促進其凋亡，但對其周期無明顯影響。同時，微泡處理使內(nèi)皮細胞ET1分泌升高，NO釋放降低。
　　(3)血小板活化程度明顯影響微泡的分泌數(shù)量，同時與微泡內(nèi)

6、miRNA的水平也存在相關(guān)性。血小板活化促進微泡的分泌，同時也顯著增加miR-223、miR-126、miR-16、miR-17和miR-222的水平。生物信息學(xué)預(yù)測和已知的實驗發(fā)現(xiàn)這些miRNA可能靶向調(diào)控與內(nèi)皮細胞生長和功能密切相關(guān)的基因。
　　結(jié)論:
　　(1)血小板活化主要分泌直徑100 nm左右的微泡;
　　(2)血小板來源的微泡對內(nèi)皮細胞凋亡、遷移和分泌功能具有調(diào)控作用;
　　(3)血小板微泡對內(nèi)皮細