血小板TLR4在LPS誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中作用機(jī)制的體外研究.pdf

1、膿毒癥（sepsis）是指各種致病微生物或其毒素存在于血液或組織中，機(jī)體對(duì)感染產(chǎn)生的一種嚴(yán)重全身性炎癥反應(yīng)，是外科感染、重度創(chuàng)傷、大手術(shù)后、重型急性胰腺炎和休克等的常見并發(fā)癥，進(jìn)一步加重可發(fā)展為嚴(yán)重膿毒癥,并發(fā)感染性休克、急性肺損傷（acute lung injury，ALI）、急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distresssyndrome，ARDS）甚至多器官功能障礙綜合征（multiple organ dy

2、sfunction syndrome，MODS）。由革蘭陰性桿菌的胞壁成份—脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起的內(nèi)毒素血癥則為最常見最典型的膿毒癥。肺臟是膿毒癥時(shí)最易受損的器官，急性肺損傷出現(xiàn)最早，發(fā)生率最高，表現(xiàn)為低氧血癥和呼吸窘迫。膿毒癥是ALI 高發(fā)病率和高死亡率的主要原因。肺毛細(xì)血管通透性增高是膿毒癥ALI的發(fā)病基礎(chǔ)和重要的病理生理特征，肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（pulmonary microvascular e

3、ndotheliAlcell，PMVEC）的損傷起著關(guān)鍵性作用。PMVEC呈連續(xù)性襯在血管腔內(nèi)面，肺血管通透性依賴于其活性。
　　 越來越多的研究證明中性粒細(xì)胞和血小板積極參與膿毒癥炎癥反應(yīng)并在其過程中發(fā)揮協(xié)同作用，包括血小板參與免疫激活及協(xié)同中性粒細(xì)胞誘捕細(xì)菌。TLR4（Tol llike receptor 4，TLR4）屬于Tol l 樣受體家族成員，表達(dá)于多種不同類型的細(xì)胞，為L(zhǎng)PS刺激后啟動(dòng)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和相應(yīng)的免疫

4、反應(yīng)，是LPS的特異性跨膜受體。近年來對(duì)內(nèi)毒素血癥中血小板活化機(jī)制的研究認(rèn)為，膿毒癥時(shí)血小板表達(dá)功能性TLR4，激活中性粒細(xì)胞形成中性粒細(xì)胞胞外菌網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）捕獲殺滅細(xì)菌；而血小板通過中性粒細(xì)胞依賴的方式首先聚集于肺毛細(xì)血管和肝血竇使血小板數(shù)量減少，進(jìn)而導(dǎo)致肺和肝臟功能障礙甚至衰竭。
　　 膿毒癥ALI時(shí)，PMVEC的損傷是由LPS的直接作用，還是由血小板與中性粒細(xì)

5、胞的共同參與所致？血小板TLR4在此過程中發(fā)揮了怎樣的作用？其他細(xì)胞的TLR4是否在PMVEC 損傷作用中亦起到重要的作用？這些方面的研究未見報(bào)道。
　　 研究目的:
　　 本研究通過LPS 刺激體外培養(yǎng)的小鼠PMVEC，觀察血小板和（或）中性粒細(xì)胞對(duì)PMVEC 損傷的影響，探討離體條件下血小板LPS 特異性受體TLR4對(duì)小鼠膿毒癥ALI時(shí)PMVEC 損傷的介導(dǎo)作用；進(jìn)而闡明血小板TLR4在膿毒癥ALI時(shí)的作用，為膿毒癥

6、ALI 機(jī)制的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究方法:
　　 1.原代培養(yǎng)小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞采用酶消化、免疫磁珠二次分選法分離純化小鼠PMVEC，貼壁培養(yǎng)法體外擴(kuò)增，CCK-8 法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，流式細(xì)胞儀對(duì)其表型進(jìn)行鑒定。
　　 2.分別分離正常小鼠和TLR4 缺失小鼠的血小板及正常小鼠的中性粒細(xì)胞血小板分離：小鼠異氟烷持續(xù)吸入麻醉后心臟穿刺

7、以ACD （vol:vol 1:9）抗凝收集全血，約1.2～1.5ml/只，室溫下1500rpm 離心5min，取上層富含血小板血漿再以3000rpm 離心10min，沉淀即為血小板。所得血小板活化程度通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板表面CD41和CD62P/P-selectin的表達(dá)而測(cè)定，僅將未活化的血小板用于實(shí)驗(yàn)。
　　 中性粒細(xì)胞分離：ACD抗凝血用小鼠中性粒細(xì)胞分離液進(jìn)行分離，所得中性粒細(xì)胞活化程度通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面的L

8、y-6G和CD11b的表達(dá)而測(cè)定，僅將未活化的中性粒細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　 3.實(shí)驗(yàn)分組和處理取2～5代的PMVEC 以105/ml 接種于12孔板，5％ FBS，100U/100mg/ml 雙抗DMEM，37 ℃ 5％ CO2培養(yǎng)2d 左右，待細(xì)胞85％～90％融合即可用于實(shí)驗(yàn)。將分離的血小板和中性粒細(xì)胞分別以終濃度約5×107/ml/孔和5×105/ml/孔與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)?！把“濉辈糠?，隨機(jī)分為4組：對(duì)照組即內(nèi)皮細(xì)胞組（E

9、組）、內(nèi)皮細(xì)胞+血小板組（EP組）、內(nèi)皮細(xì)胞+中性粒細(xì)胞組（EN組）、內(nèi)皮細(xì)胞+血小板+中性粒細(xì)胞組（EPN組）；“血小板TLR4 ”部分，隨機(jī)分為2組：內(nèi)皮細(xì)胞+血小板+中性粒細(xì)胞組（EPN組）和內(nèi)皮細(xì)胞+TLR4 缺失血小板+中性粒細(xì)胞組（EP-/-N組）；每組分1h、6h、12h、18h、24h 5個(gè)亞組，每個(gè)亞組6孔，分別加入終濃度為1μg/ml的LPS，孵育。各亞組分別于第1、6、12、18和24h 收集上清液和內(nèi)皮細(xì)胞待測(cè)。

10、
　　 4.檢測(cè)指標(biāo)①原代培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞鑒定：光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞免疫表型、CCK-8 法測(cè)繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。②流式細(xì)胞儀測(cè)定分離的血小板和中性粒細(xì)胞免疫表型。③光鏡觀察各組內(nèi)皮細(xì)胞處理后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的形態(tài)和數(shù)量改變。④DAPI 染色后熒光顯微鏡觀察處理后24h 各組內(nèi)皮細(xì)胞胞核變化。⑤流式細(xì)胞儀測(cè)定各組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量、損傷率和活化率。⑥流式細(xì)胞儀測(cè)定上清液細(xì)胞數(shù)量及活化率。
　　

11、 結(jié)論:
　　 1.建立了一種有效分離、純化、擴(kuò)增小鼠PMVEC的方法。
　　 2.血小板在離體LPS 誘導(dǎo)的小鼠PMVEC 損傷中與中性粒細(xì)胞協(xié)同作用，且兩者缺一不可；P-selectin的表達(dá)不能作為離體條件下內(nèi)毒素血癥環(huán)境中血小板活化的特異性標(biāo)志。
　　 3.血小板TLR4在離體LPS 誘導(dǎo)的小鼠PMVEC 損傷中促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的活化及血小板、中性粒細(xì)胞的粘附，加重炎癥狀態(tài)下中性粒細(xì)胞對(duì)PMVEC