血小板微泡對內(nèi)皮細(xì)胞作用及機(jī)制的體外研究.pdf

1、微泡是細(xì)胞間信號傳導(dǎo)的一種載體，包含蛋白質(zhì)、mRNA、miRNAs等多種生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等病理生理過程中扮演重要角色。血小板是循環(huán)中微泡的主要來源，臨床研究顯示在冠心病、房顫等患者的循環(huán)中，微泡含量顯著增加，并且和多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。我們前期的研究顯示，凝血酶激活血小板后產(chǎn)生的微泡中miRNAs的表達(dá)譜顯著改變，并且可以被內(nèi)皮細(xì)胞吸收，在轉(zhuǎn)錄后途徑發(fā)揮作用。MiRNA是一種長度約為21-23個核苷酸的

2、非編碼單鏈RNA分子，通過特異性結(jié)合mRNA序列，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化或者降解mRNA，調(diào)控基因的表達(dá)。隨著研究的進(jìn)展，miRNA在各種病理生理過程中的調(diào)節(jié)作用越來越受到重視，并有可能成為疾病診斷的標(biāo)志物和未來生物治療的靶點(diǎn)。
　　研究目的:
　　(1)建立完善血小板來源微泡(PMP)的分離、提取及鑒定方法，并比較漩渦震蕩和凝血酶兩種刺激方式對微泡及其表面膜蛋白的影響;(2)研究凝血酶刺激產(chǎn)生的血小板微泡對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、遷移、活性氧(R

3、OS)產(chǎn)生、一氧化氮(NO)及炎癥因子分泌的作用;(3)初步探索微泡對內(nèi)皮細(xì)胞中miRNAs表達(dá)的影響，及其中的miRNA對內(nèi)皮細(xì)胞上述表型的作用及機(jī)制。
　　研究方法:
　　(1)使用凝血酶刺激和漩渦震蕩刺激血小板產(chǎn)生微泡，使用梯度離心法收集血小板來源的微泡，利用流式細(xì)胞儀分析微泡的大小、數(shù)量及表面的膜蛋白，透射電鏡分析微泡的內(nèi)在結(jié)構(gòu)。(2)應(yīng)用H2O2誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，應(yīng)用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測凝

4、血酶刺激所得微泡對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響;平板劃痕和Transwell評價(jià)微泡對內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響;Elisa法確定微泡對內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎癥因子的影響;Griess法測定微泡對內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO的影響;ROS試劑盒結(jié)合Image J軟件檢測微泡對內(nèi)皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生的作用。(3)實(shí)時定量PCR測定微泡對內(nèi)皮細(xì)胞microRNAs表達(dá)譜的改變作用。挑選其中改變最明顯的microRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并測定其對內(nèi)皮細(xì)胞上述各種表型的影響。應(yīng)用雙熒光素酶

5、報(bào)告基因驗(yàn)證可能相對應(yīng)的靶基因。
　　研究結(jié)果:
　　(1)流式細(xì)胞儀鑒定顯示，阿司匹林可以有效抑制血小板微泡的產(chǎn)生，凝血酶和漩渦震蕩刺激血小板均可產(chǎn)生大量微泡。通過凝血酶刺激和漩渦震蕩刺激并用梯度離心法可以提取純度較高的血小板微泡。微泡膜表面的具有復(fù)雜的蛋白成分，表達(dá)多種來源于血小板的膜蛋白。漩渦震蕩和凝血酶刺激獲得的微泡表面CD63表達(dá)差異明顯（55.38±5.27％vs43.50±3.86％，p＜0.05）。透射電鏡顯

6、示微泡內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，電子密度不一，包含α顆粒、糖原顆粒、線粒體等復(fù)雜成分。(2)凝血酶刺激所得血小板微泡可以促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡（25.59±9.50％vs12.42±1.23％，p＜0.05）、細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生(0.140±0.010/pixelvs0.109±0.010/pixel，p＜0.05)及IL-1β的分泌（2.67±0.87pg/ml vs1.25±0.41pg/ml，p＜0.05），抑制其遷移（平板劃痕:

7、47.99±4.65％vs61.68±2.80％，p＜0.05;Transwell:123±15vs206±14，p＜0.01）和NO的分泌(27.68±1.70mmol/L vs34.13±1.47mmol/L，p＜0.01)。(3)微泡處理內(nèi)皮細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)miR-223(150.60±29.63vs1.00±0.75，p＜0.001)、miR-320（20.84±18.58vs1.07±0.98，p＜0.05）顯著升高。腺病毒轉(zhuǎn)染

8、miR-223后促進(jìn)了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(22.45±2.34％vs12.95±0.36％，p＜0.001)、抑制了其遷移（平板劃痕:66.66±4.21％vs71.59±4.02％，p＜0.05;Transwell:151±17vs215±29，p＜0.05），但對細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生、炎癥因子及NO的分泌無明顯影響。Targetscan軟件及文獻(xiàn)回顧預(yù)測NRF1、ATP7A、ZEB1三種miR-223的靶基因。在mRNA水平上

9、，miR-223對內(nèi)皮細(xì)胞中NRF1、ATP7A、ZEB1的表達(dá)并無顯著作用。雙熒光素酶報(bào)告基因顯示，miR-223對NRF13'UTR串聯(lián)的報(bào)告基因活性無明顯抑制，結(jié)合位點(diǎn)突變后報(bào)告基因活性無明顯增強(qiáng)。
　　研究結(jié)論：
　　(1)血小板極易激活并產(chǎn)生大量表達(dá)血小板表面膜蛋白成分、大小結(jié)構(gòu)不一、內(nèi)容物復(fù)雜的微泡;通過梯度離心法可以提取純度較高的血小板微泡;凝血酶刺激所得微泡表面CD63較漩渦震蕩刺激所得微泡表面明顯降低。(2