血小板微顆粒影響內(nèi)皮細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)及機(jī)制.pdf

1、目的:
　　 檢測(cè)血小板微顆粒(platelet-derived microparticles,PMPs)誘導(dǎo)后的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)及其傳導(dǎo)通路。研究不同濃度PMPs及與細(xì)胞不同作用時(shí)間下對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的差異,探討PMPs影響內(nèi)皮細(xì)胞VEGF釋放的可能機(jī)制及其臨床意義。
　　 方法:
　　 應(yīng)用流

2、式細(xì)胞術(shù)(FCM)從貧血小板血漿(PPP)中提取血小板微顆粒(PMPs),特異性熒光抗體CD61-FITC標(biāo)記PMPs,上機(jī)檢測(cè)其數(shù)量并應(yīng)用半自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血小板微顆粒中蛋白含量。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在37℃、5％CO2的條件下常規(guī)培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)采用3～4代細(xì)胞；按1×105/ml密度接種于9.6 cm2的六孔板中,24h后換液,生長(zhǎng)接近100％時(shí),即內(nèi)皮細(xì)胞約數(shù)為2.5×106時(shí)進(jìn)行PMPs的干預(yù)。應(yīng)用不同干預(yù)濃度的PMPs與人臍靜脈內(nèi)皮

3、細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間,每一組4個(gè)樣本,分別在干預(yù)2小時(shí)、4小時(shí)、24小時(shí)后收集內(nèi)皮細(xì)胞,應(yīng)用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞VEGF、VEGF受體Flt/KDR、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K)以及胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,EgK)的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)

4、,經(jīng)過(guò)二磷酸腺苷(ADP)激活血小板,可以從貧血小板血漿(PPP)中提取并檢測(cè)到高純度的血小板微顆粒。不同干預(yù)濃度的PMPs與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間后,半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)測(cè)定mRNA表達(dá),VEGF mRNA的表達(dá)水平在對(duì)照組(PMPs未干預(yù)組)顯著高于PMPs干預(yù)濃度為10μg/ml、30μg/ml、50μg/ml、100μg/ml組(P<0.05),與之相反,KDR mRNA表達(dá)水平在對(duì)照組顯著低于四組不同濃度PM

5、Ps組mRNA表達(dá)水平(P<0.05)。ERKmRNA表達(dá)水平在PMPs50μg/ml組顯著高于對(duì)照組(P<0.05),P13KmRNA表達(dá)水平在PMPs100μg/ml組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。PMPs干預(yù)細(xì)胞不同時(shí)間,VEGF mRNA的表達(dá)水平在對(duì)照組顯著高于PMPs干預(yù)24小時(shí)組(P<0.05),KDRmRNA的表達(dá)水平在對(duì)照組顯著低于PMPs干預(yù)4小時(shí)、24小時(shí)組(P<0.05),PI3KmRNA表達(dá)水平在PMPs干預(yù)

6、24小時(shí)組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 貧血小板血漿法血小板經(jīng)ADP激活,可使其釋放大量PMPs。PMPs干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞后,PMPs被激活,可能釋放大量的VEGF,使得內(nèi)皮細(xì)胞自身的VEGFmRNA表達(dá)受到負(fù)反饋抑制而減少,而內(nèi)皮細(xì)胞VEGF受體2即KDRmRNA表達(dá)明顯增加,其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的兩個(gè)關(guān)鍵酶PDK及ERKmRNA表達(dá)也明顯升高,即PMPs可能通過(guò)PI3K/Akt及MAPK/ERK等